以脉络学说为指导探讨内皮细胞损伤对AS发病影响及通心络干预作用研究

发布时间：2019-10-08 10:22

【摘要】：动脉粥样硬化(Atherosclerosis AS)是心脑血管疾病的共同病理基础,内皮细胞功能障碍则是AS的始动因素并贯穿全过程；血小板作为血液成分之一,通过活化后释放诸多生物活性物质或膜糖蛋白,介导血小板与内皮细胞相互作用,参与到AS免疫、炎症、血栓形成等病理阶段。导师传承《内经》“血脉”理论,系统构建脉络学说,提出“脉络一血管系统病”概念,并提出其核心理论一营卫理论,AS及其相关心脑血管病即属于脉络病变范畴。基于营气与血管内皮相关性,血液成分与营血相关性,本研究探讨血小板活化对内皮细胞损伤致AS的影响及通络代表性药物通心络胶囊的干预作用,继而丰富发展脉络学说指导AS防治的科学内涵。目的：以脉络学说营卫理论为指导,阐释营血病变对脉络一血管系统功能结构影响在AS发病中的作用及通心络干预效应。以“营血”中血小板为研究对象,采用在体动物和离体细胞实验,研究血小板活化CD40L/CD40对内皮细胞损伤的影响,同时探讨通络代表药物通心络对血小板活化诱导的内皮细胞损伤的保护作用机制。方法：(1)动物实验：70只新西兰大白兔随机分为正常组、模型组、通心络低、中、高剂量组、阿托伐他汀组和阿司匹林组,每组10只。除正常组外,其余各组均喂饲高脂饲料,用药组在给予高脂饲料的同时给予相应药物灌胃,每日1次,连续灌胃12周。实验结束时留取主动脉标本及血清进行指标检测。围绕血管内皮相关指标：采用全自动生化分析仪检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平；ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)含量；油红O染色和HE染色观察主动脉脂质沉积、内膜病理改变。围绕血小板结构和功能指标：采用透射电镜观察血小板超微结构；血细胞分析仪检测血小板参数变化；流式细胞仪观察血小板胞内Ca2+变化；ELISA法检测血小板分泌血小板因子4(PF4)、可溶性CD62P (sCD62P)表达变化；ELISA法检测0、2、4、8、12周兔血清可溶性CD40L (sCD40L)表达变化；免疫组化定位检测主动脉CD40L、CD40表达情况；Western blot检测主动脉CD40L、CD40、caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平,RT-PCR检测主动脉CD40L、CD40mRNA:表达变化。(2)细胞实验：体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),采集健康人静脉血分离血小板,①制备静息血小板悬液、活化血小板悬液、通心络血小板悬液,分别与内皮细胞共培养。采用动态活细胞成像系统观察血小板聚集、粘附及释放过程,观察血小板对内皮细胞凋亡与增殖的影响,同时观察内皮细胞线粒体膜电位动态变化过程；流式细胞仪检测血小板膜CD40L、CD62P表达变化；ELISA法检测血小板分泌sCD40L表达变化。②为探讨CD40L/CD40在活化血小板损伤内皮细胞中的作用,采用CD40蝉克隆抗体阻断活化血小板上清液中CD40L与内皮细胞CD40结合,实验分为正常组、ADP阴性对照组,静息血小板组、活化血小板组、通心络组、CD40L配体单克隆抗体组,采用MTS法检测内皮细胞生存活性改变,荧光法检测内皮细胞线粒体膜电位改变。③为验证CD40琏诱导内皮细胞凋亡中的作用,采用重组可溶性人CD40L (rshCD40L)建立内皮细胞损伤模型,实验分为正常组、rshCD40L模型组、通心络低、中、高剂量组,采用Western blot检测内皮细胞ERK1/2相关信号通路ERK1/2、p-ERK1/2、CyclinD、C-Myc、Cytc、Bax、Bcl-2、Caspase3蛋白表达变化。④为探讨通心络抑制CD40L诱导内皮细胞凋亡的可能机制,采用质粒转染技术沉默ERK1/2基因表达,实验分为正常组、siRNA对照组、siRNA组、通心络组、通心络+siRNA组,采用Western blot检测内皮细胞ERK1/2相关信号通路p-ERK1/2、CyclinD、C-Myc、Cytc蛋白表达变化。结果：(1)动物实验：①高脂喂养建立兔AS模型中血管内膜增厚,血清血脂TC、TG、LDL-C升高,炎症因子TNF-α、IL-1β、hs-CRP表达增多,主动脉内皮细胞caspase3、Bax蛋白表达增多,Bcl-2蛋白表达降低。通心络能够降低血脂水平,减少TNF-α、IL-1β、hs-CRP含量,抑制内膜增生,同时降低caspase3、Bax蛋白表达,升高Bcl-2蛋白表达(P0.05R0.01)。②AS模型中血小板结构改变,分泌sCD40L、PF4、sCD62P明显增多,细胞内钙离子水平增加。免疫组化、Western blot及RT-PCR结果显示主动脉CD40L、CD40蛋白和基因表达增强。通心络明显改善血小板结构,降低血小板分泌sCD40L、PF4、sCD62P水平,同时降低胞浆内钙离子含量,并可下调CD40L、CD40蛋白和基因表达(P＜0.05,P＜0.01)。(2)细胞实验：①血小板活化后发生聚集、粘附和释放反应,CD62P、CD40L、sCD40L水平表达增高,降低内皮细胞NO水平、升高ET-1、表达,同时降低内皮细胞生存活性,促进线粒体膜电位下降(P0.05,P0.01)。②血小板CD40L/CD40轴通过抑制ERK1/2活性在活化血小板诱导内皮细胞线粒体凋亡途径中发挥重要作用,增加Cytc、caspase3、Bax蛋白表达,降低CyclinD、Bcl-2蛋白表达(P0.05,0.01)③通心络抑带CD62P、CD40L、sCD40L表达,同时降低活化血小板与内皮细胞的粘附能力。通心络可能通过激活ERK1/2信号相关通路抑制活化血小板CD40L/CD40诱导的内皮细胞凋亡(P0.05,P0.01)。结论：①通心络对活化血小板诱导的内皮细胞损伤具有一定的治疗及保护作用,可能与其抑制血小板活化,减少血小板与内皮细胞粘附能力,下调CD40L/CD40活性有关。②通心络抑常CD40L/CD40诱导的内皮细胞凋亡,其机制可能与激活ERK1/2活性、减少Cytc、C-Myc蛋白表达,上调CyclinD蛋白表达有关。
【图文】：

主动脉

各组主动脉CD40L表达情况

内皮细胞,动态过程

逡逑结果逡逑１．内皮细胞调亡动态观察逡逑利用活细胞成像系统观察血小板活化对内皮细胞调亡影响的动态过程，结果示：静息逡逑血小板上清液作用于内皮细胞连续观察１化，内皮细胞细胞核完整，边缘清晰，夷光强度逡逑均一弥散，并可看到细胞分裂增殖（呁色为细胞核）。将经ＡＤＰ活化处理的血小板上清液逡逑作用于内皮细胞同样连续观察ｌＯｈ，则见内皮细胞核浓染、固缩和边缘化，细胞核体积变逡逑小，，核碎裂，出现调亡小体。将通必络预处理的血小板上清液作用于内皮细胞观察１化，逡逑与活化血小板组比较，可观察到通屯、络能明显促进细胞核完整，并促进内皮细胞分裂。（图逡逑５－１）逡逑图５－１血小板对内皮细胞调亡及增值动态过程观察逡逑
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R259

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