沙芪制剂对KKAy小鼠降糖作用及机制研究

发布时间：2020-04-16 19:57

【摘要】：目的:沙芪制剂(SQ)是一种探索性研究的新蒙药制剂,此研究观察沙芪制剂对自发性Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠的降糖作用及探究其作用的机制,为该制剂治疗Ⅱ型糖尿病提供实验依据,为进一步开发利用作基础。方法:1.将KKAy小鼠分为模型对照组(MCG)、沙芪制剂低剂量组(LSQG,0.8g/kg)、沙芪制剂中剂量组(MSQG,1.6g/kg)、沙芪制剂高剂量组(HSQG,3.2g/kg)和盐酸二甲双胍组(MEG,2.5g/kg),另设同源C57BL/6小鼠为正常对照组(NCG)。各小鼠均灌胃给药8周,每日1次。每周检测沙芪制剂对体重变化,24h进食量,24h饮水量;第0W、2W、4W、8W周测定各组小鼠随机血糖和给药禁食2h血糖,给药第6周测定糖耐量,24h空腹血糖动态变化,24h随机血糖动态变化,8周结束后测定各脏器系数、血清血糖、胰岛素、血脂、肝功指标。2.将小鼠的肝脏和胰腺组织病理切片进行HE染色,肝脏组织进行糖原(PAS)染色、Masson染色、油红染色,观察沙芪制剂对KKAy小鼠肝组织病理的影响。3.免疫组化染色观察沙芪制剂对肝脏PTP1B蛋白表达的影响;使用Western Blotting法检测肝脏组织中的PTP1B蛋白表达情况;PCR法检测PTP1B核酸表达情况。4.免疫组化染色观察沙芪制剂对肝脏P-IRS2、PI3K、P-AKT、GSK3β等蛋白表达的影响;使用Western Blotting法检测肝脏组织中的PI3K、AKT、P-AKT、GLUT4、GSK3β等蛋白表达情况;PCR法检测IRS2、PI3K、AKT、GLUT4、GSK3β等核酸表达情况。5.因未测出沙芪制剂LD50,故测其最大耐受量以及对小鼠体重和各脏器系数的影响。取健康小鼠40只,随机分为两组,每组20只,雌雄各半。第一组为沙芪制剂高剂量组,12小时内灌胃给予最大容积(0.2m L/10g)、最大给药浓度(1g/m L)的沙芪制剂3次(间隔3小时),总剂量为60g/kg,相当于临床人应用生药量的380倍。第二组为空白对照组,灌胃一次给予等容积的蒸馏水。结果:1.随着时间的推移,各组小鼠体重逐渐增加,与正常组比较,模型组小鼠体重明显增加(P0.01);沙芪制剂各组小鼠体重有逐渐降低趋势,但与模型组比较无统计学差异(P0.05);阳性组对小鼠体重也无明显影响。与正常组比较,模型组小鼠24h进食量和饮水量明显增加(P0.01);与模型组比较,沙芪制剂各组对小鼠进食量有减少趋势,但无统计学意义(P0.05);给药4周后沙芪制剂各组和阳性组小鼠饮水量开始降低,自第7周高剂量饮水量明显低于模型组,与阳性组相近(P0.01)。与正常组比较,模型组小鼠的随机血糖、给药禁食2h血糖显著上升(P0.01);与模型组比较,沙芪制剂各组和阳性组小鼠的随机血糖、给药禁食2h血糖显著降低(P0.01);糖负荷30min时,与模型组比较,阳性组抑制血糖升高的幅度最大(P0.01),其次为沙芪制剂高剂量组、沙芪制剂中剂量组、沙芪制剂低剂量组(P0.01);糖负荷60min时,沙芪制剂各组小鼠血糖水平明显低于模型组(P0.01),阳性组降低幅度最大,接近于正常组;糖负荷120min时,阳性组降低幅度最大(P0.01),沙芪制剂各组小鼠血糖水平低于阳性组;AUC顺序为正常组阳性组沙芪制剂高剂量组沙芪制剂中剂量组沙芪制剂低剂量组模型组(P0.01)。与正常组比较,模型组小鼠24h空腹血糖显著上升(P0.01);与模型组比较,沙芪制剂各组对小鼠24h空腹血糖禁食2h、6h、12h时有下降趋势(P0.05),禁食18h、24h空腹血糖比模型组高。与正常组比较,模型组小鼠24h随机血糖显著上升(P0.01);与模型组比较,沙芪制剂高剂量组对小鼠10:00血糖显著下降(P0.01),其余时间点无显著变化。与正常组比较,模型组小鼠肝脏系数、脾脏系数、肾脏系数显著增加(P0.01);与模型组比较,沙芪制剂各组和阳性组组小鼠肝脏系数、脾脏系数、肾脏系数无显著变化。2.血糖指标:相比于正常对照组,模型对照组的血清GHb、GSP、AGEs水平显著上升(P0.01);相比于模型对照组,沙芪制剂各组和阳性组的血清GHb、GSP、AGEs水平均显著减少(P0.01)。胰岛素指标:相比于正常对照组,模型对照组的血清INS和C肽水平显著上升(P0.01);较模型对照组,沙芪制剂各组和阳性组的血清INS和C肽值均显著减少、HDL-C水平显著减少(P0.01)。血脂指标:相比于正常对照组,模型对照组的血清TC、TG、LDL-C水平显著上升;相比于模型对照组,沙芪制剂各组和阳性组的血清TC、TG、LDL-C水平明显减少,HDL-C水平有增加的趋势。肝功能指标:相比于正常对照组,模型对照组的血清AST、ALT、直接胆红素水平显著上升(P0.01);相比于模型对照组,沙芪制剂各组和阳性组的血清AST、ALT不同程度的降低、直接胆红素水平显著降低(P0.01)。相比于正常对照组,模型对照组的血清白蛋白水平显著下降(P0.01)、总蛋白有降低趋势;相比于模型对照组,沙芪制剂各组和阳性组的血清总蛋白、白蛋白水平不同程度的上升(P0.05或P0.01)。3.HE染色病理切片:相比于正常对照组,模型对照组的胰腺、肝脏组织病理改变明显加重。相比于模型对照组,沙芪制剂各组和阳性组的胰腺、肝脏组织病理改变明显减轻。糖原(PAS)染色病理切片:相比于正常对照组,模型对照组的肝糖原含量明显减少。相比于模型对照组,各给药组的肝糖原含量明显提高。Masson染色:相比于正常对照组,模型对照组的纤维化明显增多。相比于模型对照组,各给药组的肝脏组织纤维化明显减少。油红染色:相比于正常对照组,模型对照组的肝脏组织脂肪含量明显增多。相比于模型对照组,各给药组的肝脏组织脂肪含量明显减少。4.免疫组化观察PTP1B蛋白结果表明:与正常组比较,模型组小鼠肝脏组织的PTP1B蛋白表达显著升高(P0.01);与模型组比较,沙芪制剂各组和阳性组肝脏组织的PTP1B蛋白表达显著下降(P0.01)。Western Blotting法检测小鼠肝脏组织的PTP1B蛋白结果表明:与正常组比较,模型组小鼠肝脏组织的PTP1B蛋白表达显著上调(P0.01);与模型组比较,沙芪制剂各组和阳性组肝脏组织的PTP1B蛋白表达显著下调(P0.01);PCR法检测小鼠肝脏组织的PTP1B的m RNA表达结果表明:与正常组比较,模型组小鼠肝脏组织的PTP1B的m RNA表达显著上调(P0.01);与模型组比较,沙芪制剂各组和阳性组肝脏组织的PTP1B的m RNA表达显著下调(P0.01)。5.免疫组化观察胰岛素信号通路关键因子P-IRS2、PI3K、P-AKT、GSK3β蛋白结果表明:与正常组比较,模型组小鼠肝脏组织的P-IRS2、PI3K、P-AKT蛋白表达显著下降、GSK3β蛋白表达显著升高(P0.01);与模型组比较,沙芪制剂各组和阳性组肝脏组织的P-IRS2、PI3K、P-AKT蛋白表达显著升高、GSK3β蛋白表达显著下降(P0.01)。Western Blotting法检测小鼠胰岛素通路关键蛋白PI3K、AKT、P-AKT、GLUT4、GSK3β的结果表明:与正常组比较,模型组小鼠肝脏组织的PI3K、P-AKT、GLUT4蛋白表达显著下调、GSK3β白表达显著上调(P0.01)、AKT蛋白表达无显著差异;与模型组比较,沙芪制剂各组和阳性组肝脏组织的PI3K、P-AKT、GLUT4蛋白表达显著上调、GSK3β蛋白表达显著下调(P0.01)、AKT蛋白表达无显著差异。PCR法检测小鼠肝脏组织的IRS2、PI3K、AKT、GLUT4、GSK3β的m RNA表达结果表明:与正常组比较,模型组小鼠肝脏组织的IRS2、PI3K、AKT、GLUT4的m RNA表达显著下调、GSK3β的m RNA表达显著上调(P0.01);与模型组比较,沙芪制剂各组和阳性组肝脏组织的IRS2、PI3K、AKT、GLUT4的m RNA表达显著上调、GSK3β的m RNA表达显著下调(P0.01)。6.沙芪制剂小鼠急性毒性试验,以最大耐受量(剂量为60g/kg,相当临床拟用量的380倍)口服,观察14天,结果高剂量组未发现毒性反应,所有给药小鼠未出现死亡,也没有发现其它与给药有关的表现。结论:1.沙芪制剂能够降低Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠的血糖,促进糖代谢,改善糖耐量,稳定血糖。2.沙芪制剂可调节Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠的血脂水平,改善脂代谢。3.沙芪制剂能够减少Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠胰岛β细胞的损伤,减轻肝脏、胰腺组织的病变,对胰腺、肝脏组织起到一定的保护作用;沙芪制剂能够增加Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠肝糖原的含量;沙芪制剂能够减少Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠肝脏纤维化;沙芪制剂能够降低Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠肝脏脂肪含量。4.沙芪制剂能够上调胰岛素信号通路关键因子IRS2、PI3K、AKT、GLUT4蛋白和基因的表达,下调PTP1B、GSK3β蛋白和基因表达,可能是其发挥降糖作用的内在机制。5.沙芪制剂没发现急性毒性。
【学位授予单位】：内蒙古民族大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R29

【参考文献】