【摘要】：研究背景气血是人体生命活动的基本物质,气血间的相互作用和关联影响着人体机能活动状态。气滞血瘀证和气虚血瘀证是血瘀证的两个重要分型,已有一些研究证明,二者存在病理表现、生物学基础上的相同点和不同点,二者在疾病的发生发展过程中亦存在相关性。但是,作为凝血系统的中心环节,气滞血瘀证和气虚血瘀证对血小板影响方面的研究还较少。在本实验室前期工作基础上,我们发现,运用不规律的睡眠剥夺造模法,存在从3周气滞血瘀到6周气虚血瘀的病理转化过程。两种证型均存在体重减轻、毛色枯黄等症状,又在脉搏、舌象、痛觉、心功能、血液流变学等宏观表征方面存在差异。气滞血瘀证与气虚血瘀证在微观上的变化和异同何在,作为血瘀的关键环节,血小板功能和形态是否有变化,两证的血小板功能和形态是否存在差异,血小板是否可以作为“气血交互于脉”中气血与脉相互作用的枢纽,以及作为抗凝药物的常见作用环节,中医药治疗不同类型血瘀证是否可以从血小板方面找到相关理论的实验验证及物质基础,这些问题亟待我们探索和讨论。目的及意义本研究的目的是探究气虚血瘀证与气滞血瘀证大鼠模型血小板功能的变化与差异,同时给予益气活血方和理气活血方作为药物反证,并探究理气活血方与益气活血方对两种血瘀证血小板功能的调节治疗机制。本研究的意义在于在微观上研究气滞血瘀证与气虚血瘀证大鼠模型血小板的变化,运用理气活血方与益气活血方对不同血瘀证候大鼠模型的血小板功能进行调节,并探究其变化的原因和机理,从而寻找气滞血瘀证与气虚血瘀证血小板功能的差异,为中医临床辨证提供实验佐证,充实其理论基础,为973课题“气血交互于脉”的假说提供一定的实验佐证。方法1.运用自制的水环境小平台盒子,进行不规律不完全的睡眠剥夺的造模方式。每个盒子内放六个小平台,五只大鼠,上盖铁丝网盖。实验时在盒子内注入约3cm高的水,大鼠可以在平台上自由活动,但不能俯卧入睡。保证每周总的剥夺时间达到112个小时,平均每天16个小时,气滞血瘀证的造模时间为3周,气虚血瘀证的造模时间为6周,并分别在第2周和第5周给予理气活血方和益气活血方对模型进行反证,同时验证和探讨理气活血方和益气活血方的药效及作用机制。2.宏观表征评价:检测各组大鼠的体重、脉搏、舌象、痛觉、心功能、血液流变学等宏观指标,验证模型成功及药效。3.基因组学检测:通过microRNA基因组学评价气滞血瘀证大鼠模型和气虚血瘀证大鼠模型microRNA的变化,寻找与血小板活化相关的靶基因以及理气活血方和益气活血方可能的作用靶点。4.血小板功能及形态学研究:AA、ADP、RISTO三种诱导剂诱导血小板聚集,流式细胞术检测血小板表面膜糖蛋白CD62p和CD63的表达率,扫描电镜和透射电镜观察血小板的外部形态及内部结构,ELISA酶联免疫法检测各组大鼠血浆PECAM-1的含量。结果1.宏观表征:(1)脉搏:同期正常组大鼠脉象平缓,不大不小,均匀规律,流利有力。气滞血瘀模型组大鼠脉搏强度较正常组明显升高(P0.01),呈现高、陡,不够流利,含有小的起伏,节奏较快等特点。理气活血方能明显改善气滞血瘀模型大鼠的脉搏,使脉搏强度明显降低(P0.01),脉象明显缓和改变。气虚血瘀模型组大鼠脉搏强度较正常组明显降低(P0.01),具有低、平,不够流利,节奏较慢等特点。益气活血方能明显改善气虚血瘀模型大鼠的脉搏,使强度明显升高(P0.01),脉象呈现搏动更加有力,节奏加快等特点。(2)体重:气滞血瘀模型组大鼠与气虚血瘀模型组大鼠体重较各自同期正常组均明显减轻(P0.01)。理气活血方和益气活血方对气滞血瘀模型和气滞血瘀模型大鼠体重均无明显改善。(3)舌象:正常组大鼠舌象为淡红舌,薄白苔。气滞血瘀证模型组大鼠舌质红暗,舌面R、G、B值较同期正常组均显著性降低(P0.01,P0.05),理气活血方可改善气滞血瘀模型大鼠舌象,舌面的R值和G值明显升高(P0.05)。气虚血瘀证模型组大鼠舌质紫暗,舌面R、G、B值较同期正常组均有显著性降低(P0.01,P0.05),益气活血方可改善气虚血瘀模型大鼠舌象,使舌面的R、G、B值均显著性升高(P0.01,P0.05)。(4)痛觉:气滞血瘀模型组大鼠的痛觉反应时间较正常组明显缩短(P0.01),理气活血方可明显延长气滞血瘀模型大鼠的痛觉反应时间(P0.01)。气虚血瘀模型组大鼠的痛觉反应时间较正常组明显延长(P0.01),益气活血方可明显缩短气虚血瘀模型大鼠的痛觉反应时间(P0.01)。(5)大鼠心脏超声心动图:与同期正常组比较,气滞血瘀模型组大鼠心脏左室舒张期体积明显降低(P0.05),每搏输出量明显降低(P0.05),心输出量明显降低(P0.01);理气活血方对气滞血瘀模型大鼠的各项心功能参数均无明显改善。与同期正常组比较,气虚血瘀模型组大鼠心脏左室舒张期直径明显降低(P0.05),左室舒张期体积明显降低(P0.05),每搏输出量明显降低(P0.05),心输出量明显降低(P0.05);益气活血方能明显改善气虚血瘀模型大鼠的心功能,可使心率明显升高(P0.05),左室舒张期直径、舒张期体积、每搏输出量均有升高趋势,但无统计学意义,心输出量明显升高(P0.01)。(6)血液流变学:气滞血瘀模型组大鼠在低切、中切、高切条件下的血液粘度较正常组明显升高,具有统计学差异(P0.05);理气活血方可明显改善气滞血瘀模型大鼠在低切条件下的血液粘度(P0.05)和中切和高切条件下血液粘度(P0.01)。气虚血瘀模型组大鼠在低切、中切、高切条件下的血液粘度较正常组明显升高,具有统计学差异(P0.01);益气活血方能明显改善气虚血瘀模型大鼠的全血粘度,使中切条件下的血液粘度明显降低(P0.05),高切条件下的血液粘度明显降低(P0.01)。2.microRNA基因组学研究:(1)气滞血瘀证模型大鼠与气虚血瘀证模型大鼠较各自同期正常组均有多条microRNA表达差异,表明其血小板活化可能是受相关的基因调控。(2)2条miRNA在两个模型组中均表达差异:rno-miR-344a-5p和rno-miR-762。其中rno-miR-344a-5p与CD63、P选择素、Gp1b和GpV的表达密切相关。(3)理气活血方与益气活血方发挥治疗气滞血瘀证和气虚血瘀证药效的机制可能与调控相关microRNA有关。3.血小板功能及形态学研究:(1)血小板聚集实验:由AA、ADP、RISTO三种诱导剂诱导的气滞血瘀模型组大鼠血小板最大聚集率(MAR)和平均聚集率(AAR)均较正常组明显升高,且具有统计学意义(P0.01)。理气活血方可明显降低由AA诱导的气滞血瘀模型大鼠血小板AAR(P0.05),可明显降低由ADP诱导的气滞血瘀模型大鼠血小板MAR和AAR(P0.05,P0.01)可明显降低由RISTO诱导的气滞血瘀模型大鼠血小板MAR和AAR(P0.01,P0.05)。在气虚血瘀证血小板聚集实验中,与同期正常组比较,由AA诱导的气虚血瘀模型组大鼠AAR明显升高,具有统计学意义(P0.05),由RISTO诱导的气虚血瘀模型组大鼠血小板最大聚集率(MAR)和平均聚集率(AAR)明显升高,且具有统计学意义(P0.01)。益气活血方可明显改善气虚血瘀模型大鼠的血小板聚集情况,可见由AA诱导血小板AAR明显降低(P0.05),由RISTO诱导的血小板MAR和AAR明显降低(P0.01,P0.05)。(2)血小板膜糖蛋白CD62p、CD63的表达:气滞血瘀模型组大鼠血小板CD63表达率较正常组明显升高(P0.01)。理气活血方可明显降低气滞血瘀模型大鼠血小板CD63的表达率(P0.01)。气虚血瘀模型组大鼠血小板CD62p和CD63的表达率明显升高(P0.01,P0.05)。益气活血方可明显降低气虚血瘀模型大鼠血小板CD62p和CD63的表达率(P0.01,P0.05)。(3)血小板扫描电镜观察:正常组血小板散在,不聚团,活化较少或较轻。气滞血瘀模型组大鼠血小板活化较正常组明显,扩张型血小板增多,伪足伸出明显,细胞膜表面凹凸不平,血小板有聚团现象,存在细胞间膜融合现象。理气活血方可明显抑制气滞血瘀模型大鼠血小板的活化,可见血小板的聚集现象明显改善,细胞膜较为平整圆滑,伪足伸出减少。气虚血瘀模型组大鼠血小板聚团现象较正常组明显增多,有微血栓形成。益气活血方可明显改善气虚血瘀模型大鼠血小板的聚集现象,使血小板微血栓解聚,血小板细胞膜平滑完整。(4)血小板透射电镜观察:正常组大鼠的血小板细胞膜边界清晰,血小板内颗粒清晰可见,细胞结构完整。气滞血瘀模型组大鼠血小板细胞膜有明显破损,可见血小板颗粒膜与细胞膜融合,血小板内颗粒破裂明显,颗粒膜互相融合,细胞结构破损,血小板形状发生变化,有伪足伸出倾向。理气活血方可明显改善气滞血瘀模型大鼠血小板形态,细胞膜边界清晰,对细胞内的颗粒破坏也有明显改善。气虚血瘀模型组大鼠血小板细胞膜融合明显,血小板连接成片,存在大量巨大颗粒甚至空泡,颗粒破坏严重,线粒体嵴断裂,细胞结构严重破损。益气活血方可明显改善气虚血瘀模型大鼠血小板形态,可见血小板呈类圆形,细胞膜清晰完整,细胞内颗粒膜清晰完整,线粒体结构完整。(5)血浆PECAM-1含量:气滞血瘀模型组大鼠血浆PECAM-1含量较同期正常组明显升高(P0.01);理气活血方可明显降低气滞血瘀模型大鼠血浆PECAM-1的含量(P0.01)。气虚血瘀模型组大鼠血浆PECAM-1含量较同期正常组明显升高(P0.01);益气活血方可明显降低气虚血瘀模型大鼠血浆PECAM-1的含量(P0.01)。结论1.睡眠剥夺诱导的大鼠气滞血瘀证和气虚血瘀证证候模型造模成功,模型稳定易成,符合中医病机。2.气滞血瘀证和气虚血瘀证模型大鼠血小板均活化明显,聚集率升高,血小板形态学改变,血小板间存在膜融合现象,细胞膜发生破损,颗粒释放增多,结构受损。3.气滞血瘀证模型大鼠的血小板活化与致密颗粒释放更为相关;气虚血瘀证的血小板活化特点表现为有微血栓的形成,结构受损更为严重。4.理气活血方和益气活血方均可通过抑制血小板活化,保护血小板结构达到分别治疗气滞血瘀证和气虚血瘀证的疗效。其作用机制可能与调节相关microRNA有一定关系。
【图文】：
图１大鼠超声心动图逡逑２．７血液流变学逡逑
图１－１－１气滞血瘀模型组与正常组及理气活血方组脉搏（５Ｔ士ｓ，邋ｎ＝１０）逡逑注：与正常组比较，＊Ｐ＜０．０５，“Ｐ＜０．０１；与模型组比较，＃Ｐ＜０．０５，，邋＃＃Ｐ＜０．０１逡逑
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R228;R-332
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本文编号：2676023
