益气活血方对缺血心肌细胞骨架相关蛋白及AMPK调节途径影响的研究

发布时间：2020-06-11 10:44

【摘要】：背景:2017年中国心血管病报告指出,心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的死亡率占总死亡的40%以上,由于老龄化等多因素的影响,中国CVD负担日渐加重,患病率及死亡率处于上升阶段。研究发现,心肌缺血缺氧后,心肌细胞骨架系统可以表现出不同程度的损伤,细胞骨架相关蛋白及其微观结构的变化也有可能成为评估心肌缺血损伤的标准,AMPK既能调控细胞能量代谢,还与细胞骨架重构相关,因此明确AMPK对心肌细胞骨架的调控机制,对防治心血管疾病具有重要作用。目的:揭示心肌缺血缺氧后,心肌细胞骨架的变化情况及其关键调控途径,可以为益气活血方防治心肌缺血提供理论基础和实验依据。方法:研究分为动物实验和细胞实验两部分。动物实验:构建急性心肌梗死动物模型,按照术后24小时心电图情况随机分为四个组:模型组(M)、益气活血方组(Y)、美托洛尔组(MT)和开胸不造模的假手术组(S),共3天、7天和28天三个时间点,进行超声、HE染色、透射电镜检查,采用Western blot和免疫荧光法观察各组心肌细胞骨架蛋白以及p-AMPK的表达情况。细胞实验:采用缺氧诱导H9c2心肌细胞模型,将心肌细胞分为5组:对照组(C)和缺氧模型组(M),100μg/ml益气活血方组(Y1),200μ g/ml益气活血方组(Y2),400μg/ml益气活血方组(Y4)。通过实时无标记细胞功能分析仪监测细胞活力,测定细胞上清液中LDH、MDA、SOD水平,通过鬼笔环肽染色法标记细胞骨架染色,Western Blot检测各组心肌细胞骨架微管相关蛋白表达以及HIF-1α蛋白的表达。加入AMPK抑制剂Compound C,并筛选出最佳浓度100μ g/ml(Y1),将心肌细胞分为5组:对照组(C)和缺氧模型组(M),益气活血方组(Y1),益气活血方+AMPK抑制剂Compound C组(Y1+CC),AMPK抑制剂Compound C组(CC)。Western Blot检测各组心肌细胞骨架相关蛋白以及p-AMPK的表达。结果:1.各组心梗大鼠心肌组织病理结果。S组心肌细胞排列规则,结构清晰,超微结构Z线及M线清晰可辨,粗细肌丝排列整齐,肌原纤维垂直于细胞轴线排列,线粒体可见均匀的基质颗粒及排列紧密的线粒体嵴;M组梗死区室壁变薄,梗死边缘区可见充血及炎性细胞带,横切面观察发现心肌组织细胞肿胀,间隙较大,边缘处于不规则形状,超微结构Z线开始排列错乱,线粒体肿胀、基质缺失,细肌丝断裂,粗肌丝堆积,线粒体肿胀异常且失去完整的形态结构,线粒体嵴模糊不清;Y组和MT组心肌细胞结构紊乱,部分坏死,梗死边缘区可见炎性细胞带,横切面观察发现心肌细胞仍肿胀不规则,但细胞间间隙减少,炎症纤维减少,心肌细胞形状趋向假手术组,Y组Z线排列呈波浪状,粗细肌丝已融合无明显分界,但较M组线粒体膜结构尚完整。2.各组大鼠梗死边缘区微管、微丝蛋白表达的情况。Western Blot结果显示:与S组相比,3个时间点的M组大鼠在心肌组织内的微管蛋白、MLCK、Cx43、p-MLC-2表达水平都有显著性降低,p-AMPK、MLC-2表达显著性升高(P0.01);与M组相比,两种药物组心肌组织内的α-tubulin、MAP4、MLCK和Cx43、p-MLC-2水平有不同程度的显著升高,p-AMPK、MLC-2水平有显著性降低(p0.05);免疫荧光结果与WB结果趋势相同。3.益气活血方对缺氧后H9c2心肌细胞的保护作用。与C组相比,缺氧12h和24h后细胞活性均明显降低(P0.001)。与M组相比,缺氧12h和24h后不同浓度益气活血方对细胞预处理可以保护心肌细胞免受缺氧诱导的损伤,而当缺氧12h时,Y1、Y2、Y4组心肌细胞活性均明显升高(P0.05)。选择12h的缺氧时间作为后续实验的模型。与C组比较,M组上清液中的LDH和MDA显著释放(P0.01),而与M组比较,Y1、Y2、Y4处理后细胞上清液中LDH和MDA则显著降低(P0.01)。此外,M组上清液中SOD含量明显减少(P0.01),Y1处理后可显著增加H9c2细胞在缺氧条件下SOD的释放(P0.01)。采用FITC标记的鬼笔环肽染色细胞骨架,发现C组正常心肌细胞的骨架结构被细胞核包围,排列成网格,染色均匀。缺氧12h后,M组心肌细胞骨架受损,结构模糊,晶格结构严重受损,同时荧光强度较C组降低,部分区域未染色,形成空泡。各给药组可改善骨架结构损伤,荧光强度高于单独缺氧损伤组,染色异常和核碎裂程度减轻,以Y1给药组改善较明显。通过Hoechst33258染色法检测各组心肌细胞的凋亡率发现,与C组相比,M组缺氧12h损伤后细胞核不规则,分成碎亮片状,出现凋亡小体等特征,而与M组相比,Y1和Y2可减少核浓缩,减少细胞碎片。当给予了AMPK抑制剂Compound C时,细胞核致密浓染和碎片明显增加,凋亡小体增多;分别与Y1和Y2组比较,Y1CC和Y2CC均能有效缓解碎片的增加。4.益气活血方通过AMPK/MAP4途径对缺氧后H9c2心肌细胞骨架微管蛋白的保护作用。结果显示,与C组比较,M组α-tubulin和β-tubulin的表达降低(p0.01)。同时,与M组相比,当Y1组α-tubulin和P-tubulin的表达升高(p0.01)。基于前期缺氧12h时细胞骨架微管蛋白的变化,最后选择浓度为100μ g/ml的益气活血方进行实验。与C组相比,模型组中p-AMPKα(Thr172)显著升高,MAP4的表达显著降低(P0.01),Y1处理H9c2心肌细胞后可显著升高p-AMPKα的表达,上调MAP4的表达(p0.01),CC可明显消除Y1对微管蛋白的保护作用。5.益气活血方通过AMPK/MLCK途径对缺氧后H9c2心肌细胞骨架微丝蛋白的保护作用。结果显示,与C组相比,M组中MLCK水平及p-MLC-2水平明显降低(p0.01),而MLCK、p-MLC-2的表达受到CC的抑制,说明益气活血方对缺氧后H9c2心肌细胞骨架损伤中的肌球蛋白的影响与AMPK磷酸化有关。6.益气活血方对缺氧后H9c2心肌细胞HIF-1α蛋白表达的影响。与C组相比,M组H9c2细胞胞浆内、胞核内HIF-1α蛋白表达水平显著性升高(p0.01),经过给药处理后,Y1组细胞质内和细胞核内的HIF-1α蛋白表达水平能够一定程度回归对照组水平(p0.01)。研究结论:1.益气活血方可以通过保护心梗后心肌细胞超微结构,改善左心功能,减轻心梗后心室重构程度。2.益气活血方可以促进缺血缺氧后心肌细胞骨架微管相关蛋白α-tubulin、β-tubulin、MAP4,微丝相关蛋白MLCK、p-MLC-2的表达,表明益气活血方具有保护缺血缺氧后心肌细胞骨架的作用。3.AMPK抑制剂Compound C能够抑制益气活血方上调p-AMPK、微管蛋白MAP4和微丝蛋白MLCK、p-MLC-2的表达,提示益气活血方可能通过AMPK/MAP4、AMPK/MLCK途径保护心肌细胞骨架中微管和微丝结构和功能,并且在HIF-1α-AMPK途径在缺氧心肌细胞能量代谢中发挥重要作用,从而参与调节细胞骨架结构的稳定性。因此我们认为AMPK可以作为调节细胞骨架微管蛋白及微丝肌球蛋白重塑过程相互作用网络的桥梁。
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图１邋ＡＭＰＫ调控细胞骨架相关信号通路逡逑４天然产物调控ＡＭＰＫ信号通路对心血管的作用逡逑由于西药长期服用造成的胃肠道反应、肝损害等不良反应较多，而中药特点是毒副逡逑作用小，药效独特，，可以通过多途径、多靶点、多层面来作用于疾病受体。随着科技的逡逑

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本文编号：2707788