膝骨关节炎模型大鼠腧穴敏化的肥大细胞纳米CT及电镜成像研究

发布时间：2020-06-15 02:22

【摘要】：1研究背景中医针灸历来已久,腧穴是针灸发挥临床疗效的作用点,腧穴的研究一直是针灸研究的热点,其形态学研究更是备受关注。研究学者提出腧穴具有反应疾病和治疗疾病两大功能,腧穴反应疾病是指腧穴随机体状态的改变,其功能和大小也在动态变化,机体由生理到病理的改变,可使腧穴激活而呈现出高敏感性,但腧穴是否真实存在,腧穴定位何处,腧穴是否具有确切的疗效等一直是针灸科研领域争论的焦点和核心。肥大细胞与腧穴密切相关,是腧穴组织形态学的重要组成部分,是腧穴效应的载体。当前对于腧穴敏化的研究主要包括理论研究、腧穴生物物理特性研究、敏化机制研究,为腧穴敏化的研究奠定了理论基础、拓展了研究思路;提升了腧穴研究的科学性与针对性;从敏化发生的物质基础层面为腧穴敏化的深入研究指明了方向,但目前腧穴敏化的研究尚缺乏客观指标的支撑,还需要进一步的研究和讨论。2研究目的本实验采用软X射线纳米CT技术结合透射电镜,观察膝骨关节炎大鼠(KOA)阳陵泉穴、非穴在腧穴敏化的不同时间节点穴区肥大细胞(MC)超微结构及三维立体结构的动态变化,探讨腧穴敏化的MC机制,阐明MC敏化的一般规律,为腧穴敏化的物质基础提供客观显像依据,丰富与完善针灸腧穴理论。3研究方法3.1动物、细胞分组及模型制备方法实验选取SPF级成年健康雄性SD大鼠共72只,随机分为正常组、生理盐水组和模型组,每组24只。体质量(155±5)g。实验前适应性喂养1周,正常组相同饲养条件下不做任何处理。参考文献[1]并改进,模型组于实验第Od,将3mg单碘乙酸盐(MIA)溶于50μL无菌生理盐水溶液,通过髌下韧带注射至双侧膝关节腔内,建立MIA诱导的大鼠实验性KOA动物模型,共24只。生理盐水组的模型制备分两天进行,实验第0天,随机抽取18只SD大鼠,将50μL无菌生理盐水溶液通过髌下韧带注射至双侧膝关节腔内,作为假阳性对照;实验第1天,取余下6只SD大鼠依上诉方法注射生理盐水,两天共24只,为提取微透析液做准备。大鼠皮肤MC购买于北京科瑞思搏生物科技有限公司,参考文献[2]并改进,本实验组采取将MC接种于镍网上进行细胞培养,直接使用镍网冷冻制样观察的方法进行实验。提前备好从各组大鼠阳陵泉穴、非穴处提取的微透析液,将微透析液与完全培养基以一定比例混合,放入培养箱预热;选取细胞量合适的镍网加入微透析液与完全培养基的混合溶液,于细胞培养箱中刺激1小时,根据微透析液的组别将细胞分为正常组、生理盐水组、模型组;取出镍网,迅速放入液氮中低温冷冻制样,软X射线纳米CT成像观察。3.2指标检测透射电镜观察不同时间节点、不同穴区局部MC超微结构改变(囊泡是否发生融合、是否存在空泡、胞内致密颗粒占比);软X射线纳米CT技术观察腧穴敏化时大鼠皮肤MC的形态结构改变,客观呈现MC三维立体结构的动态变化过程。4研究结果4.1透射电镜结果镜下观察模型组阳陵泉穴在14d、21d可见特征性的MC脱颗粒改变:颗粒融合,胞外可见已脱出的颗粒或正在脱出的颗粒,胞内伴随颗粒密度降低,出现遗留的空泡。模型组阳陵泉穴穴区MC致密颗粒占比在第7d时与正常组及生理盐水组相比,差异没有统计学意义(P0.05),第14d、21d,致密颗粒占比显著低于正常组及生理盐水组(P0.01);随时间的延长,模型组阳陵泉穴穴区MC致密颗粒占比呈下降趋势,不同时间点差异有统计学意义(P0.01);各组非穴穴区不同时间节点,MC致密颗粒占比无明显变化(P0.05)。4.2软X射线纳米CT成像结果根据细胞内各亚结构所表现出的灰度值即线性吸收系数的不同,进行细胞器分割。软X线纳米CT成像结果显示,可观察到细胞膜结构、细胞核、不同密度的颗粒及空泡、高吸收的脂滴样结构。模型组阳陵泉穴穴区局部微透析液刺激过的MC在第14d时部分颗粒线性吸收系数变小,灰度值降低,经3D渲染后可见有正在脱出的颗粒及部分空泡包裹的颗粒,推断为颗粒部分脱出或脱颗粒后新物质正在生成的过程,颗粒融合后肿胀变大密度降低直径增大。在第21d时线性吸收系数继续降低,在断层扫描片层图上观察到呈黑色或接近黑色的泡状结构。经正常组、生理盐水组阳陵泉穴穴区微透析液及正常组、生理盐水组、模型组非穴穴区局部微透析液刺激过的MC在第14d及21d,形态结构均未见明显改变。5研究结论(1)MC参与了腧穴敏化过程,机体由生理到病理的转变使MC发生脱颗粒现象,致密颗粒占比显著下降,从微观水平以客观成像的方式确认了腧穴的敏化特性。(2)特定腧穴敏化可能需要一定的时间来实现,敏化效应持续存在,并伴随疾病发展呈动态变化。(3)特定疾病状态下腧穴敏化具有腧穴特异性,腧穴是区别于非穴部位具有特定功能的特殊部位。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R245;R-332
【图文】：

透射电镜观察,盐水,节点,颗粒

图１各组非穴不同时间节点ＭＣ透射电镜观察逡逑注：Ｎ为正常组，ＮＳ为生理盐水组，Ｍ为模型组。ａ列为２１ｄ的部分放大图（黑色箭头表示ａ列中与逡逑２１ｄ邋的相同部位，以供参考和定位），７ｄ、１４ｄ、２ｌｄ邋（Ｘ８２００）邋ｂａｒ＝ｌ邋ｕｍ；邋ａ列（Ｘ１１５００）邋ｂａｒ＝ｌ逡逑Ｕ邋ｉｎ逡逑２．邋１．２各组不同时间点阳陵泉穴穴区ＭＣ电镜成像逡逑正常组、生理盐水组所有时间点及模型组第７ｄ阳陵泉穴穴区ＭＣ，未观察到脱颗粒逡逑样改变，颗粒电子密度相对较高。模型组阳陵泉穴在第１４ｄ、２１ｄ穴区ＭＣ内可观察到颗逡逑粒密度有明显区别，根据密度的大小可人为将颗粒分为高、中、低密度三个等级。模型逡逑组阳陵泉穴在７ｄ时偶可见少量的较低密度的颗粒；１４ｄ、２１ｄ颗粒密度差异更加明显，逡逑低密度颗粒逐渐增多，在２１ｄ中胞内可见低密度颗粒成片分布。在ＭＣ周围可见正在脱逡逑出的颗粒或己脱出的颗粒，其形态结构与胞浆内颗粒无明显区别。颗粒与颗粒之间或颗逡逑粒与细胞膜之间膜相互融合，形成颗粒脱出的通道，内容物肿胀变大，经管道释放至细逡逑胞外，同时胞内颗粒密度降低，排列松散呈点状分布。颗粒释放后膜结构重新闭合，胞逡逑

透射电镜观察,盐水,脱颗粒,空隙

同时胞内颗粒密度降低，排列松散呈点状分布。颗粒释放后膜结构重新闭合，胞逡逑内出现边缘空隙或空泡样的结构，边缘空隙－方面是由不完全脱颗粒形成，另一方面也逡逑可能是完全脱颗粒后新颗粒Ｕ：在生成所致，参见图２、图３。逡逑４１逡逑

【相似文献】