巨噬细胞迁移抑制因子在电针治疗COPD大鼠中的作用研究

发布时间：2020-06-19 04:22

【摘要】：目的:1.研究慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)模型大鼠体内炎性因子的含量变化、巨噬细胞迁移抑制因子(macrophase migration inhibitory factor,MIF)及其受体复合物CD74/CD44、受体介导的信号通路p38MAPK、AKT的mRNA及蛋白相对表达量,探讨MIF在COPD大鼠病理生理过程中可能作用机制;2.本实验通过电针COPD模型大鼠的双侧“足三里”(ST36)和“肺俞”(BL13)穴,从病理形态、炎症介质等方面观察电针的治疗效果,电针与MIF及其受体复合物、受体介导的信号通路之间的关系,探讨MIF在电针治疗COPD大鼠中的作用机制,从而为针刺治疗COPD提供有力依据;3.观察MIF特异性拮抗剂ISO-1/针刺联合ISO-1对COPD大鼠肺组织病理学形态、肺通气功能、MIF及其受体复合物、受体介导信号通路的表达的影响,探讨ISO-1在针刺治疗COPD大鼠中的可能作用。方法:1.分组:70只健康成年SPF级体质量250~300g的雄性SD大鼠,采用随机数字表法分为7组(N=10),分别为正常组、模型组、模型+电针组、模型+ISO-1+电针组、模型+DMSO+电针组(溶媒对照组)、正常+ISO-1+烟熏组、正常+DMSO+烟熏组(溶媒对照组)。2.干预:采用香烟烟熏联合气管滴注脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的复合方法制备COPD大鼠模型,烟熏1个月后通过测定大鼠肺功能以及观察大鼠肺组织病理形态判断COPD大鼠模型制备成功与否。模型+ISO-1+电针组大鼠在电针前30min腹腔注射MIF特异性拮抗剂ISO-1(120ug/kg),溶媒对照组以等量的1%DMSO溶解液腹腔注射,持续7天;正常+ISO-1+烟熏组大鼠隔日于每次烟熏前30min腹腔注射ISO-1,溶媒对照组以等量的1%DMSO溶解液腹腔注射,持续1个月。3.电针:电针组选取大鼠下肢双侧“足三里”(ST36)穴和“肺俞”(BL13)穴,针灸针刺入大鼠双侧穴位后,同侧两针柄分别连接电针治疗仪的输出端,参数选择采取4/20 Hz交替频率,持续0.5 ms,强度设置为1-3 mA,以引起大鼠下肢微微抖动为宜。每日进行针刺,每次电针时间为30分钟,持续7天。4.检测:ELISA法检测各组大鼠血清、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和肺组织内MIF、TNF-α、IL-1β和IL-8含量;定量PCR和Western blot法检测各组大鼠肺组织内MIF及CD74、CD44、p38MAPK、AKT mRNA以及蛋白相对表达量;免疫组化法观察各组大鼠肺组织中CD74、CD44的表达及分布。结果:1.大鼠在烟熏联合LPS气管滴注干预后,与正常组大鼠比较,其肺通气功能明显下降,用力肺活量容积(FVC),第0.1秒用力呼气容积(FEV_(0.1)),第0.3秒用力呼气容积(FEV_(0.3)),FEV_(0.1)/FVC以及FEV_(0.3)/FVC均显著降低(P0.01);COPD大鼠肺组织出现大量炎性细胞浸润,肺泡腔扩大,肺泡结构发生病理改变,符合临床COPD患者的病理形态学改变;此外,COPD模型组大鼠血清、BALF和肺组织内炎性因子含量显著升高(P0.01),模型组大鼠肺组织内MIF、CD74、CD44、p38MAPK、AKT的mRNA和蛋白表达,以及肺组织中CD74、CD44的免疫阳性表达水平升高(P0.01)。2.电针治疗COPD大鼠一周后,与模型组大鼠比较,模型+电针组大鼠肺通气功能指标均显著升高(P0.01);模型+电针组大鼠血清内MIF和IL-1β含量显著降低(P0.01),TNF-α和IL-8降低(P0.05),其BALF和肺组织内炎性因子含量明显降低(P0.01);模型+电针组大鼠肺组织内MIF、CD74、CD44、p38MAPK、AKT的mRNA和蛋白表达,以及肺组织中CD74、CD44免疫阳性表达水平均有降低(P0.01)。3.电针前给予大鼠腹腔注射MIF拮抗剂ISO-1,与模型+电针组相比,模型+ISO-1+电针组大鼠血清和BALF中TNF-α、IL-1β、IL-8含量降低(P0.01),MIF含量降低(P0.05),肺组织内MIF、IL-1β和IL-8含量降低(P0.01),TNF-α表达水平降低(P0.05);肺组织内MIF、CD74、CD44、p38MAPK、AKT的mRNA和蛋白表达量显著降低(P0.01);肺组织CD74、CD44免疫阳性表达分别呈不同程度地降低(P0.01;P0.05),模型+ISO-1+电针组与溶媒对照组间各检测指标有显著差异(P0.01)。4.烟熏前给予大鼠ISO-1预处理,与模型组相比,正常+ISO-1+烟熏组大鼠血清、BALF和肺组织内炎性因子含量显著下降(P0.01);大鼠肺组织内MIF、CD74、CD44、p38MAPK、AKT的mRNA和蛋白表达,以及肺组织中CD74、CD44免疫阳性表达水平降低(P0.01);正常+ISO-1+烟熏组与溶媒对照组间各检测指标有显著差异(P0.01)。结论:1.香烟烟熏联合气管滴注LPS的复合方法可成功复制COPD模型大鼠,本实验中制备的COPD模型大鼠符合临床中COPD主要病理学变化以及肺功能特点。2.MIF在香烟烟雾及LPS的诱导下大量释放,且能够通过其受体复合物CD74/CD44激活p38MAPK、AKT信号通路,使下游炎症介质的表达增加,可知MIF参与了COPD的病理生理过程。3.电针治疗可以有效抑制MIF的生成,下调或抑制其受体复合物CD74/CD44及受体后p38MAPK、AKT信号通路,进而抑制炎症介质的表达,改善肺部炎症及肺功能,提示电针对COPD模型大鼠治疗效果显著,其作用机制可能与抑制MIF及其受体通路等有关。4.MIF特异性拮抗剂ISO-1预处理能够有效抑制COPD大鼠肺组织内MIF表达,通过其受体复合物阻断p38MAPK、AKT信号通路,从而下调下游炎症因子表达水平,发挥对COPD大鼠的保护作用;此外,电针联合MIF特异性拮抗剂ISO-1治疗COPD大鼠具有协同作用,能够显著下调大鼠体内炎症水平,改善其肺通气功能,对COPD大鼠治疗效果显著。
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R245
【图文】：

假说,课题,肺俞,炎性因子

COPD 模型大鼠的双侧“足三里”和“肺俞”穴能够抑制 MIF 及其受体复合物CD74/CD44、受体介导的信号通路 p38MAPK、AKT，从而下调炎性因子的释放，减缓病理发展和组织损伤，为针刺治疗 COPD 提供有力依据（图 1）。

烟熏,大鼠,腹腔注射

图 2 大鼠烟熏箱Fig.2 The smoking box方法1 腹腔注射剂量 120ug/kg 参考 Wang F Z 等[34]实验用量，将 ISO-SO 中（DMSO 稀释于生理盐水），稀释的 DMSO 被用作溶媒对型＋ISO-1＋电针组大鼠在电针前 30min 腹腔注射 MIF 特异性拮媒对照组以等量的 1%DMSO 溶解液腹腔注射，持续 7 天；正常＋大鼠隔日于每次烟熏前 30min 腹腔注射 ISO-1，溶媒对照组以等溶解液腹腔注射，持续 1 个月。方法组大鼠被安置于安静的环境中，给予大鼠 10%水合氯醛（0.2mL

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