基于自噬基因ATG5探讨针刺调控内质网应激诱导气道高反应T淋巴细胞亚群稳态机制研究

发布时间：2020-06-30 02:00

【摘要】：气道高反应性(Airway Hyperrecation,AHR)是指气管、支气管对特异性抗原刺激和非特异性刺激呈现的过度反应,是支气管哮喘病人区别于正常人的重要特征之一。以气道高反应为主要特征的支气管哮喘是危害人类健康的最常见慢性病之一,全球范围有超过3.58亿的哮喘患者。哮喘常有家族倾向,受遗传因素影响,伴随着生活方式的改变,其发病率和死亡率呈上升趋势。针刺作为作为传统中医疗法之一,对气道高反应的治疗效果临床疗效得到了中西医呼吸学专家的广泛认可,但针刺治疗气道高反应的具体机制研究甚少,制约了针刺治疗气道高反应在更广泛范围的认可和应用。目前普遍认为,炎症反应是AHR发生的重要机制之一。当气道受到过敏原或其他外界刺激后,淋巴细胞比例和自噬失衡、炎症细胞因子水平升高、炎症细胞浸润、气道上皮细胞损害等因素导致了 AHR。内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)和自噬是细胞抗损伤的重要机制,两者可通过多种途径参与T淋巴细胞的增殖/分化和炎症性反应,包括气道高反应。自噬基因ATG5在气道高反应中起着重要作用。本课题组先前的研究中证实了针刺可通过调节CD4+T淋巴细胞亚群平衡改善小鼠气道高反应的症状。因此,本研究拟建立卵清蛋白ovalbumin(OVA)致敏气道高反应C57小鼠及条件性ATG5基因敲除小鼠模型,观察针刺大椎、肺俞、足三里对OVA致敏小鼠气道反应性的影响,并以此为基础探讨针刺通过自噬基因ATG5介导内质网应激-自噬在CD4+T淋巴细胞稳态中的作用机制,为针刺在气道高反应治疗的临床应用提供理论和实验室依据。第一章文献研究一、哮喘的研究进展二、针灸在哮喘治疗中的应用三、内质网应激与哮喘的关系四、细胞自噬与哮喘的关系五、自噬基因ATG5与哮喘的关系第二章实验研究第一节针刺对气道高反应模型气道高反应性及气道炎症的影响目的:观察针刺大椎、肺俞、足三里对OVA致敏小鼠气道反应性和气道炎症的作用方法:一、气道高反应模型的构建及分组干预18只C57小鼠随机分成3组,Sham组、AHR组(气道高反应模型组),AAHR组(针刺治疗组),每组6只。Sham组:实验的第0天、第7天和第14天共3次在腹腔注射生理盐水0.2ml。于第15日起开始以1%戊巴比妥钠0.lml腹腔注射麻醉,隔日一次,至第27天结束。于第28、29、30天,每天以生理盐水雾化,20min/天,连续3天。AHR组:于实验的第0天、第7天和第14天共3次在腹腔注射含10μg OVA及1mg Al(OH)3的生理盐水0.2ml,于第15日起开始腹腔注射1%戊巴比妥钠0.1ml麻醉,隔日一次,至第27天结束。于第28、29、30天,以含1%OVA的生理盐水(70mg OVA加入7ml无菌生理盐水中)给致敏小鼠雾化。AAHR组:气道高反应模型构建同AHR组,于第15日起选择大椎、肺俞(双)、足三里(双)进行针刺,隔日针刺1次,共针7次,至第27天结束针刺。于第28、29、30给致敏小鼠雾化,方法同AHR组。二、指标检测1.无创肺功能检测清醒动物的特殊气道阻力记录乙酰甲胆碱刺激后sRaw值。2.HE染色观察各组小鼠肺组织病理切片中气道与肺组织的形态结构变化。3.瑞氏染色观察并统计BALF中白细胞百分比变化。结果:一、无创肺功能检测结果显示,与Sham组相比,AHR组小鼠在乙酰甲胆碱浓度为3.125 mg/ml至50mg/ml激发剂量时sRaw改变百分比升高,差异有统计学意义;经针刺治疗后,AAHR组小鼠在各浓度Mch激发后,sRaw改变百分比均低于AHR组,差异均有统计学意义。二、肺组织病理HE染色结果显示,正常组小鼠肺组织支气管粘膜上皮细胞排列规则,未见炎性细胞浸润,支气管内无明显分泌物;AHR组支气管粘膜出现充血性水肿,上皮细胞可见局灶性脱落,皱折增多,支气管管腔内及肺间质可见明显的分泌物;AAHR组支气管粘膜上皮细胞排列趋于整齐,粘膜下充血性水肿程度减弱,支气管管腔内及肺间质中分泌物明显减少。三、对BALF中细胞瑞氏染色结果计数分析发现气道高反应模型组的BALF中白细胞总数明显增加,而针刺组白细胞总数明显减少。同时,AHR组的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分比明显高于Sham组,巨噬细胞明显低于Sham组(均P0.05)。经针刺干预后,嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分比明显降低,巨噬细胞百分比明显升高。结论:本研究成功制备了 C57小鼠气道高反应模型,针刺大椎、肺俞、足三里穴可以改善其气道高反应,减轻气道炎症,是一种有效的治疗方案。第二节针刺对气道高反应模型T淋巴细胞亚群的影响目的:观察针刺大椎、肺俞、足三里对气道高反应小鼠的Th1/Th2和Treg/Th17淋巴亚群平衡的作用方法:一、气道高反应模型的构建及分组干预二、指标检测1.ELISA法分别检测血清和肺泡灌洗液(BALF)中TGF-β,IL-17,IFN-y,IL-4的含量变化。2.流式细胞术检测脾脏调节性T细胞、Th17细胞、Th1细胞、Th2细胞,观察T淋巴细胞亚群变化。结果:一、在血清和BALF中,AHR组TGF-β,IL-17,和IL-4含量均高于Sham组,而AHR组 IFN-y 含量低于Sham组(P0.05)。与 AHR组比较,针刺 AAHR组 TGF-β,IL-17,和IL-4显著降低,IFN-y含量显著升高。二、流式细胞术检测结果显示,与Sham组比较,AHR组小鼠调节性T细胞和Th1细胞比例显著降低,Th17细胞和Th2细胞比例显著升高。经针刺干预后,与模型组(AHR组)比较,AAHR组调节性T细胞和Th1细胞比例显著升高,Th17细胞和Th2细胞比例显著降低(均P0.05)。结论:气道高反应模型表现出Th1/Th2和Treg/Th17细胞比例失衡的状态,并伴随相应的细胞因子分泌的紊乱,针刺大椎、肺俞、足三里穴可以调节T淋巴细胞比例及其炎症因子的分泌,从而减轻气道炎症。第三节针刺对气道高反应模型内质网应激和自噬的影响目的:观察针刺大椎、肺俞、足三里对气道高反应小鼠内质网应激-自噬的作用方法:一、气道高反应模型的构建及分组干预二、指标检测1.RT-PCR和Western blot检测各组小鼠肺组织自噬相关基因、蛋白ATG5、LC3II及内质网应激相关基因、蛋白PERK1、IRE-1、ATF6、Grp78的表达变化。2.透射电子显微镜观察肺组织细胞超微结构,观察自噬体的形成。结果:一、气道高反应模型组小鼠的自噬基因及蛋白ATG5、LC3II,内质网应激相关基因及蛋白PERK1、IRE-1、ATF6、Grp78的mRNA和蛋白表达水平,与Sham组比较,均明显升高(均P0.05)。经针刺干预后,上述基因和蛋白的表达水平表现出不同程度的下调,差异均具有统计学意义(均P0.05)。二、透射电镜观察,气道高反应模型组小鼠肺组织细胞超微结构可见较多典型的自噬小体,多数呈现封闭的、圆球形的双层膜结构。针刺组自噬小体数量明显减少。结论:气道高反应模型肺组织内质网应激和自噬相应的基因和蛋白表达水平升高,针刺通过调节内质网应激-自噬相关基因和蛋白的表达改善模型气道高反应性和气道炎症。第四节自噬基因ATG5在针刺调控气道高反应小鼠内质网应激-自噬诱导T淋巴细胞稳态中的作用目的:观察ATG5在针刺调控气道高反应小鼠内质网应激-自噬-T淋巴细胞稳态中的作用。方法:一、制备ATG5基因CD4+条件性基因敲除小鼠二、气道高反应模型的构建及分组干预18只ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠随机分成3组,Sham(+)组、AHR(+)组(气道高反应模型组),AAHR(+)组(针刺治疗组),每组6只。18只ATG5fl。x/floxCD4+Cre-小鼠随机分成3组,Sham(-)组、AHR(-)组(气道高反应模型组),AAHR(-)组(针刺治疗组),每组6只。模型建立方法同第一节。三、指标检测1.ATG5基因敲除小鼠的基因型鉴定。2.有创肺功能检测法记录乙酰甲胆碱刺激后气道阻力改变百分比值。3.HE染色观察各组小鼠肺组织病理切片中气道与肺组织的形态结构变化。4.瑞氏染色观察并统计BALF中白细胞百分比变化。5.流式细胞术检测脾脏调节性T细胞、Th17细胞、Th1细胞、Th2细胞,观察T淋巴细胞亚群变化。6.ELISA法分别检测血清和肺泡灌洗液(BALF)中TGF-β,IL-17,IFN-y,IL-4的含量变化。7.RT-PCR和Western blot检测各组小鼠自噬相关ATG5、LC3II蛋白及内质网应激相关蛋白PERK1、IRE-1、ATF6、Grp78的表达变化。8.透射电子显微镜观察肺组织细胞超微结构。结果:一、经实验室繁育,获得F3代小鼠82只,其中flox纯合且Cre阳性的小鼠ATG5flox/floxCD4+Cre+19 只,flox 纯合且 Cre 阴性的小鼠 ATG5flox/floxCD4+Cre-20 只。各选择18只进行后续实验。二、肺功能检测结果:ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠和 ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠在 Mch激发不同浓度时,AHR组RI增加百分比均明显高于Sham组(P0.05);经针刺治疗后,AAHR组在Mch各浓度激发时的RI值变化百分比均小于AHR组,差异均具有显著性(P0.05);同时,在 AHR 组和AAHR 组,ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠与 ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,RI增加百分比降低,差异有统计学意义(P0.05)。说明模型小鼠气道高反应增强,而针刺和ATG5条件性基因敲除可减弱气道高反应;针刺后的ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠气道阻力更接近与正常对照组。三、肺组织病理HE检测结果:ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠Sham组肺组织形态学与ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠Sham组肺组织形态学类似。ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠针刺组比ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠针刺组炎症细胞浸润明显减弱。四、肺泡灌洗液瑞氏染色结果:对于ATG5fl。x/floxCD4+Cre-和ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠,BALF中细胞瑞氏染色结果计数分析发现,AHR组BALF中白细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞明显高于Sham组,而巨噬细胞明显低于Sham组。在AHR组中,与ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠相比,ATG5frox/floxCD4+Cre+小鼠白细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞百分比显著降低,淋巴细胞百分比显著升高;在AAHR组中,与ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠相比,ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠嗜酸性粒细胞、中性粒细胞百分比显著降低;巨噬细胞和淋巴细胞百分比显著升高。ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠AAHR组更接近于Sham组。五、脾脏细胞流式细胞分析结果:在ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠和ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠中,与Sham组比较,AHR组小鼠调节性T细胞和Th1细胞比例显著降低,Th17细胞和Th2细胞比例显著升高。经针刺干预后,与AHR组比较,AAHR组调节性T细胞和Th1细胞比例显著升高,Th17细胞和Th2细胞比例显著降低(均P0.05)。在AHR 组中,ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠比 ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠,调节性 T 细胞和 Th1细胞比例显著升高,Th17细胞和Th2细胞比例显著降低(均P0.05);在AAHR组中,ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠比ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠调节性T细胞和Th1比例显著升高,Th17细胞比例显著降低(均P0.05);ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠针刺治疗组脾脏T淋巴细胞比例更接近正常对照组。六、ELISA 结果:在 ATG5flox/floxCD4+Cre-和 Cre+小鼠血清和 BALF 中,AHR 组 TGF-β,IL-17,和IL-4含量均高于Sham组,而AHR组IFN-y含量低于Sham组(P0.05)。与AHR组比较,针刺AAHR组TGF-β,IL-17,和IL-4显著降低,IFN-y含量显著升高(P0.05)。与 ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠相比,ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠 AHR 组血清中 IL-4 含量有所降低,IFN-y含量有所升高;BALF中TGF-β,IL-17,和IL-4显著降低,IFN-y含量显著升高;AAHR 组中,ATG5flox/flox。xCD4+Cre+比 ATG5flox/floxCD4+Cre-血清中 TGF-β和 IL-4 含量降低,IFN-y 含量升高(P0.05);BALF 中 TGF-β,IL-17 和 IL-4 显著降低,IFN-y含量显著升高。ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠AAHR组炎症程度更低,更接近Sham组。七、RT-PCR 基因和 Western blot 蛋白检测结果:在 ATG5flox/floxCD4+Cre-和ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠中,气道高反应模型组自噬基因ATG5、LC3II、内质网应激相关基因PERK1、IRE-1、ATF6、Grp78的mRNA和蛋白表达水平,均明显高于Sham组。经针刺干预后,上述基因和蛋白的表达水平表现出不同程度的下调,差异均具有统计学意义(均P0.05)。ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠AHR组ATG5和LC3的mRNA表达水平和自噬蛋白ATG5含量和内质网应激蛋白PERK1、IRE-1、ATF6、Grp78均低于ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠。AAHR 组中,与 ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠自噬基因 ATG5、LC3和内质网应激基因PERK1含量降低;自噬蛋白ATG5、LC3和内质网应激蛋白PERK1、IRE-1、ATF6、Grp78 含量降低,差异均具有统计学意义(P0.05)。ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠AAHR组小鼠自噬和内质网应激程度更低,更接近sham组。八、肺组织电镜结果:在ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠中,AHR组小鼠肺组织细胞超微结构可见较多典型的自噬小体,AAHR组肺组织细胞中自噬小体数量明显减少。在ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠中,AHR组小鼠肺组织细胞超微结构可见极少数量的自噬小体,而针刺组未发现典型的自噬小体结构。结论:自噬基因ATG5可介导内质网应激-自噬过程,调节T淋巴细胞亚群,调控气道高反应和气道炎症。针刺大椎、肺俞、足三里可调控ATG5基因表达,进而通过调控ER stress-自噬过程促进恢复T淋巴细胞稳态。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R245
【图文】：

针刺治疗,图片,行针,捻针

采用平补平泻法，每次留针２０邋ｍｉｎ，每隔５邋ｍｉｎ行针１次（以２００次／ｍｉｎ捻逡逑转速度，捻针２０次为行针１次）。三组小鼠均于最后一次激发２４小时后检测小鼠气逡逑道反应性和气道炎症（图１，图２）逡逑Ｄａｙ邋０逦７逦１４邋１５逦２７逦２８逦２９逦３０逦３１逡逑逦＞逡逑Ａ逦Ａ逦Ａ邋Ａ逦Ａ邋Ａ逦Ａ逦Ａ逦Ａ逡逑Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎｓ逦Ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ逦Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ逦Ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ逡逑（Ｉ．Ｐ．邋ｏｎ邋ｄａｙ邋０，７，１４）逦（邋ｅｖｅｒｙ邋ｏｔｈｅｒ邋ｄａｙ）邋（ｎｅｂｕｌｉｚｅｄ邋ｏｎ邋ｄａｙ邋２８，２９＾０）邋0ｎｄａｙ３１逡逑图１针刺治疗气道高反应模型流程图逡逑Ｆｉｇ邋１邋Ｔｈｅ邋ｆｌｏｗ邋ｃｈａｒｔ邋ｏｆ邋ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ａｉｒｗａｙ邋ｏｆ邋ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ逡逑ｍｉｃｅ邋ｍｏｄｅｌ逡逑图２邋ＯＶＡ致敏小鼠针刺治疗图片逡逑Ｆｉｇ２邋Ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ邋ｔｈｅｒａｐｙ邋ｉｎ邋ＯＶＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｍｉｃｅ逡逑１８逡逑

基线,乙酰甲胆碱,气道反应性,小鼠

逦基于自噬基因ＡＴＧ５探讨针刺调控内质网应激诱导气道高反应Ｔ淋巴细胞亚群稳态机制研究逦逡逑（二）气道反应性检测逡逑气道高反应发作时通过检测鼻部气流与胸部气流的相位差计算出特殊气道阻力逡逑（ｓＲａｗ），用ｓＲａｗ可定量反映呼吸道气流受限的程度。小鼠气道反应性的评价指标逡逑为将每个ｐ－乙酰甲胆碱激发浓度测得的ｓＲａｗ值与基线ｓＲａｗ值之差除以基线ｓＲａｗ值逡逑Ｘ邋１００％。具体操作如下：逡逑１．严格按照仪器说明书进行无创气道力学系统的校准。逡逑２．基线ｓＲａｗ检测：各个小鼠分别置于无创气道力学检测仪（ＮＡＭ）中雾化吸入逡逑生理盐水３０ｕｌ，邋２ｍｉｎ，然后记录ｓＲａｗ３ｍｉｎ，得到的ｓＲａｗ作为基线ｓＲａｗ，恢复２ｍｉｎ。逡逑３．梯度浓度乙酰甲胆碱（Ｍｃｈ）激发下检测ｓＲａｗ：基线ｓＲａｗ检测完成后，雾化逡逑吸入３．邋１２邋ｍｇ／ｍｌ邋Ｍｃｈ邋２邋ｍｉｎ，记录ｓＲａｗ邋３ｍｉｎ，恢复２ｍｉｎ，检测完成后依次增加Ｍｃｈ逡逑浓度（６．邋２５邋ｍｇ／ｍｌ，１２．５邋ｍｇ／ｍｌ，邋２５邋ｍｇ／ｍｌ，邋５０邋ｍｇ／ｍｌ），按照上述方法记录梯度浓逡逑度激发下三组小鼠ｓＲａｗ的变化。（图３）逡逑

【相似文献】