【摘要】：目的:观察夹脊电针对脊髓损伤大鼠运动功能、脊髓组织神经细胞凋亡及ERK5信号通路相关因子的影响,阐明ERK5信号通路参与夹脊电针治疗脊髓损伤的作用,揭示夹脊电针治疗脊髓损伤的抗凋亡机制。方法:实验一:观察夹脊电针对SCI大鼠行为学、组织病理形态及细胞凋亡的影响。将54只大鼠按随机数字表法分成假手术组(Sham)、模型组(Model)和夹脊电针组(EA)3组,每组根据术后1d、3d、7d时间点分为3个亚组,每个亚组6只大鼠,分别给予不同的干预方式。利用BBB评分观察各组大鼠双下肢运动功能;利用HE染色观察脊髓组织病理形态的改变;应用TUNEL检测脊髓组织神经细胞凋亡的情况。实验二:观察夹脊电针对ERK5信号通路相关因子的影响。实验分组同实验一。利用免疫组化及Western Blot观察脊髓组织中ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2和Bax的表达。实验三:观察ERK5信号通路在夹脊电针治疗脊髓损伤中的作用。将24只鞘内置管成功的大鼠按随机数字表法分成假手术组(Sham)、模型组(Model)、夹脊电针组(EA)和夹脊电针+抑制剂组(EA+EI)4组,每组6只大鼠,分别给予不同的干预方式。利用BBB评分观察各组大鼠双下肢运动功能;利用HE染色观察脊髓组织病理形态的改变;应用TUNEL检测脊髓组织神经细胞凋亡的情况;利用免疫组化及Western Blot观察脊髓组织中ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2和Bax的表达。结果:实验一:(1)BBB评分观察各组大鼠双下肢运动功能:Sham组大鼠运动功能未见明显异常;Model组大鼠出现双下肢运动功能障碍,与相同时间点Sham组相比较,BBB评分明显下降,差异显著(p0.05);EA组与Model组相比,相同时间点BBB评分均高于Model组,差异具有统计学意义(p0.05)。(2)HE染色观察病理形态学变化:HE染色结果显示,Sham组各个时间点脊髓组织结构完整,白质、灰质、脊髓前角、脊髓后角以及中央管等结构均清晰可见,细胞形态正常,胞体饱满,胞核形态正常,未见出血、神经元水肿等现象。1d时Model组可见灶形斑片状出血,组织间隙增大,正常组织结构被破坏,神经元水肿,胞体皱缩,细胞核固缩,神经细胞数量减少;EA组与Model组相比,细胞形态差异不明显,仍可见片状出血,神经元肿胀。3d时Model组仍可见出血,组织间隙变大,有空泡形成,细胞形态结构发生较为明显的改变,细胞胞体缩小,细胞核固缩成团,神经细胞明显减少,可见大量炎性细胞浸润,胶质细胞数量增多;EA组与Model组相比,组织损伤程度略轻,神经细胞数量略增多,炎性浸润及胶质细胞增多的情况较轻。7d时Model组细胞间隙进一步变大,视野中可见大量空泡,仍可见大量炎性细胞浸润,胶质细胞数量增多;EA组与Model组相比,细胞间隙明显减小,细胞形态结构优于Model组,且神经细胞数量增多,炎性浸润及胶质细胞增多的情况明显减轻。(3)TUNEL检测观察脊髓组织神经细胞凋亡:Sham组未见明显神经细胞凋亡,与同一时间点Model组和EA组相比均具有显著差异(p0.05)。1d时Model组可见神经细胞数量明显减少,凋亡增多,弥散性分布;EA组与Model组无显著差异(p0.05)。3d时Model组几乎不可见正常神经细胞,凋亡细胞数量明显增多,多集中分布于损伤区域周围;EA组与Model组相比,凋亡细胞数量明显减少(p0.05)。7d时Model组发生凋亡的神经细胞数量与3d时相比,数量减少,散在分布;EA组与Model组相比,神经细胞凋亡明显减少,形态正常的神经细胞明显增多(p0.05)。实验二:(1)免疫组化检测结果:与Sham组相比,同时间点Model组ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2表达显著增高(p0.05),并随着损伤时间延长呈表达增加趋势;与Model组相比,同时间点EA组ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2表达显著增高(p0.05),并随着损伤时间延长呈表达增加趋势;与Sham组相比,同时间点Model组Bax表达水平明显增高(p0.05),且3d表达水平最高;与Model组相比,同时间点EA组Bax表达水平明显低于Model组,具有统计学差异(p0.05)。(2)Western Blot检测结果:与Sham组相比,同时间点Model组ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2蛋白表达显著增高(p0.05),并随着损伤时间延长呈表达增加趋势;与Model相比,同时间点EA组ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2表达显著增高(p0.05),并随着损伤时间延长呈表达增加趋势;与Sham组相比,同时间点Model组Bax蛋白表达显著增高(p0.05),随受损时间延长Bax表达水平逐渐升高,在术后3d达最值,然后表达水平逐渐下降;与Model组相比,同时间点EA组Bax表达水平呈下降趋势,具有统计学意义(p0.05)。实验三:(1)BBB评分结果:与Sham组相比,Model组、EA组、EA+EI组BBB评分均有显著统计学差异(p0.05)。EA组大鼠BBB评分显著高于Model组(p0.05),且EA组大鼠BBB评分显著高于EA+EI组(p0.05)。(2)HE染色结果:Sham组脊髓组织结构正常,灰质、白质、脊髓前角、后角以及中央管结构均清晰可见,细胞形态正常,胞体饱满,胞核形态正常;Model组视野中可见细胞间隙显著增大,大量空泡样改变,神经细胞明显减少,可见大量炎性细胞及胶质细胞增多;EA组与Model组相比较,细胞间隙明显减小,细胞形态结构优于Model组,且神经细胞增多,炎性浸润及胶质细胞增多的情况明显减轻;EA+EI组与EA组比较,损伤情况较为严重,可见神经细胞数量减少。(3)TUNEL检测结果:Sham组未见明显神经细胞凋亡;与Sham组相比较,Model组神经细胞发生明显凋亡;与Model组相比较,EA组神经细胞凋亡数量明显少于Model组(p0.05);与EA组相比较,EA+EI组凋亡细胞数量明显多于EA组(p0.05)。(4)免疫组化检测结果:与Sham组相比,Model组ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2表达水平明显增高(p0.05);与Model组相比,EA组ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2表达水平明显增高(p0.05);与EA组相比,EA+EI组p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2表达水平明显降低(p0.05),ERK5表达水平无统计学差异(p0.05);与Sham组相比,Model组Bax表达水平显著增加(p0.05);与Model组相比,EA组Bax表达水平显著降低(p0.05);与EA组相比,EA+EI组Bax表达水平亦无明显变化(p0.05)。(5)Western Blot检测结果:与Sham组相比,Model组ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2蛋白的表达水平明显增高(p0.05);与Model组相比,EA组ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2蛋白的表达水平明显增高(p0.05);与EA组相比,EA+EI组p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2表达水平明显降低(p0.05),ERK5表达水平无统计性差异(p0.05);与Sham组相比,Model组Bax表达水平显著增加(p0.05);与Model组相比,EA组Bax表达水平呈下降趋势,具有统计学差异(p0.05);与EA组相比,EA+EI组Bax表达水平亦无明显变化(p0.05)结论:1.夹脊电针能够改善脊髓损伤大鼠双下肢运动功能;2.夹脊电针能够减少脊髓损伤组织神经细胞凋亡,促进脊髓功能恢复;3.脊髓损伤后,ERK5信号通路被激活,其下游因子CREB、Bcl-2的表达及活化增加;4.夹脊电针调控ERK5信号通路相关因子,进而抑制脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡,是夹脊电针促进脊髓损伤修复作用机制之一。
【学位授予单位】：黑龙江中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R245
【图文】：
图 1 ERK5 信号通路示意图5 的生物学功能K5 与细胞的增殖、分化、凋亡等功能有关[134]。Satako 等 ERK5 探究其作用时发现，被敲除基因的非洲爪蟾蜍头元分化受抑制，当强制激活 ERK5 后能够引起神经元分化神经元分化中占有重要的角色。研究发现缺血后 ERK5 能酸毒性，对神经系统起到保护作用[136]。Wang 等[137]研究血再灌注后，组织内 ERK5 被激活，抑制 ERK5 后组织，提示缺血缺氧环境下，ERK5 被激活起到抑制神经元5 信号通路与脊髓损伤损伤是一种复杂的病理过程，氧化应激、神经营养因子损伤加重。实验研究表明，激活 ERK5 能够抑制神经元
术后 1d、3d、7d 模型组与电针组大鼠 BB，BBB 运动功能评分有统计学差异（p＜0.05）。此外，d、3d、7d 电针组大鼠 BBB 评分均高于同时间点模型组，著统计学差异（p＜0.05）。（见表 1、图 2）结果表明，夹脊电针能够明显改善大鼠脊髓损伤后双下有效地治疗脊髓损伤。表 1 各组大鼠双下肢 BBB 评分组别 1d 3d 7d手术组 20.2±0.7 20.3±0.8 20.5±模型组 1.5±0.5*2.33±0.5*4.2±电针组 1.8±0.7*3.7±0.7*Δ5.7±0同时间点比较，与假手术组（S）比较，*p＜0.05；与模型组（
黑龙江中医药大学博士学位论文髓损伤组织神经细胞凋亡数量，并且在一定程度上有助于脊髓功能的。（见表 2、图 3）表 2 各组大鼠神经细胞凋亡数量组别 1d 3d 7d假手术组 1.67±0.82 2.16±1.17 2.83±0.83模型组 6.67±1.63#18.67±2.88#16.67±2.16#电针组 6.00±1.26 12.5±1.87*9.67±3.08*各组同时间点比较，模型组与假手术组比较，#p＜0.05；电针组与模型组比较，0.05。
【参考文献】
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5 王U嗙
本文编号：2757924
