电针对功能性消化不良大鼠肠神经系统的影响及机制研究

发布时间：2020-07-30 08:40

【摘要】：目的胃肠动力障碍是FD的主要病理生理基础,而ENS被称为“肠脑”,可不依赖中枢神经系统调节消化系统胃肠的运动、分泌、吸收、感觉和血液循环等功能。GDNF作为神经营养因子之一,可促进发育中神经元的增殖、分化、成熟和迁移,对出生后成熟神经元的存活也具有重要作用,可调节成熟的ENS神经元表达。GDNF是膜外蛋白,需与受体GFR-α1特异性结合后,与RET受体相互作用,从而激活ERK、PI3K等信号转导通路。ERK信号通路是GDNF下游比较经典的信号通路,在细胞信号转导网络中处于枢纽地位,已有文献表明证明pERK1/2蛋白水平在FD大鼠中异常升高。本研究以FD模型大鼠为研究对象,观察FD大鼠不同时期和胃窦与十二指肠不同部位ENS及GDNF下游ERK信号通路的变化。并以电针为干预手段,研究电针对FD模型大鼠ENS的影响,同时应用MEK抑制剂U0126,从GDNF与MEK/ERK信号通路的视角分析其相关机制。方法实验一,选用SPF级健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠40只。随机分为正常组(n=10)及FD组(n=30),FD组又按病程分为FD2周组,FD3周组、FD4周组,10只/组。正常组常规饲养,FD不同病程的3组采用夹尾刺激(30min/次,2次/天)+不规则饮食(隔日进食)的复合造模方法建立FD模型。按照FD病程的不同,造模时间分别持续2周、3周、4周。取各组大鼠胃窦与十二指肠组织,用Western Blotting(WB)分别检测胃窦与十二指肠组织PGP9.5、s100β、GFAP、GDNF、pMEK蛋白水平,透射电镜观察EGCs的超微结构。实验二、三、四、五,选用SPF级健康成年雄性SD大鼠60只。随机分为正常组(n=10)及造模组(50只)。造模组大鼠按夹尾刺激+不规则饮食的复合造模方法建立FD模型,FD模型大鼠病程为2周。将造模成功的40只大鼠随机分为模型组、电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组,10只/组。分组完成后,电针组大鼠针刺双侧足三里穴,针刺后接韩氏电针仪,电针参数为连续波,频率2Hz,电流强度为1mA,每日1次,连续10天。抑制剂组大鼠用U0126以0.3mg/kg剂量腹腔注射,1次/天,共10天。电针+抑制剂组腹腔注射U0126,方法及剂量同抑制剂组,30min后再电针足三里穴,过程同电针组。每日观察并记录大鼠一般状态,测量大鼠体重。在电针干预10天后,大鼠禁食不禁水24h,营养性半固体糊1g/100g灌胃,灌胃30min后,予以10%水合氯醛(0.35mL/100g)腹腔注射依次麻醉大鼠。剖开腹腔,进行胃排空和小肠推进试验。取下大鼠胃窦及十二指肠组织,应用HE染色光镜下观察胃窦与十二指肠组织的形态学变化;运用电镜观察大鼠胃窦与十二指肠组织EGCs的超微结构;免疫荧光染色检测胃窦与十二指肠组织s100β蛋白水平及整体分布情况;WB检测大鼠胃窦与十二指肠组织PGP9.5、GFAP、s100β、GDNF、GFRα1、RET、pMEK、pERK1/2蛋白表达;免疫组化检测胃窦与十二指肠组织GDNF蛋白水平及整体分布情况;PCR检测大鼠胃窦与十二指肠组织PGP9.5、GFAP、s100β、GDNF mRNA水平。结果1.FD大鼠ENS及GDNF/ERK信号通路的变化FD不同病程的三组大鼠胃窦与十二指肠组织PGP9.5蛋白表达较正常组下降(均P0.01);在FD不同病程的三组中,FD4周组大鼠胃窦与十二指肠组织PGP9.5蛋白水平最低,低于FD3周组(均P0.05)、FD2周组(均P0.01);FD2周组胃窦与十二指肠组织PGP9.5蛋白水平明显高于FD3周组(均P0.05)。各组大鼠s100β蛋白表达变化如下。FD不同病程的3组大鼠胃窦与十二指肠组织s100β蛋白水平较正常组显著增加(均P0.01);FD4周组大鼠胃窦与十二指肠组织s100β蛋白水平明显高于FD2周组(均P0.01)、FD3周组(均P0.05);FD2周组胃窦与十二指肠组织S100β蛋白水平较FD3周组明显减少(均P0.05)。FD2周组、FD3周组、FD4周组3组大鼠胃窦与十二指肠组织GFAP蛋白水平较正常组明显上升(均P0.01);FD不同病程的3个组中,FD4周组大鼠胃窦与十二指肠组织GFAP蛋白量最高,高于FD2周组(均P0.01)、FD3周组(均P0.05);而FD3周组大鼠胃窦与十二指肠组织GFAP蛋白表达较FD2周组明显增加(均P0.05)。透射电镜显示正常组大鼠神经纤维周围的正常EGCs结构,细胞呈不规则星形,胞核形态不规则,胞核中常染色质较多,异染色质较少,核周围分布有许多大小不等呈圆形或椭圆形的无髓神经纤维轴索,轴索附近含有少量的线粒体,还可见轴索中分布的神经丝,胞质中其他细胞器较少。FD模型大鼠可见受损的EGCs超微结构,EGCs细胞核中异染色质增多,染色质浓缩,线粒体肿胀,内质网扩张。FD2周组、FD3周组、FD4周组大鼠胃窦与十二指肠组织GDNF蛋白水平较正常组明显上升(均P0.01);FD4周组胃窦与十二指肠组织GDNF蛋白水平最高,明显高于FD2周组(均P0.01)、FD3周组(均P0.05);与FD2周组比较,FD3周组大鼠胃窦与十二指肠组织GDNF蛋白水平明显增加(均P0.05)。FD2周组、FD3周组、FD4周组大鼠胃窦与十二指肠组织pMEK蛋白水平较正常组明显增加(均P0.01);FD2周组胃窦与十二指肠组织pMEK蛋白水平低于FD3周组(胃窦P0.05,十二指肠P0.01)、FD4周组(均P0.01);与FD3周组比较,FD4周组大鼠胃窦与十二指肠组织pMEK蛋白水平明显增加(胃窦P0.05,十二指肠P0.01)。2.电针FD大鼠组织形态学、胃肠动力学的影响模型组、电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组大鼠经过造模后体重较正常组显著降低(均P0.01),且模型组、电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组四组间两两比较差异无统计意义(P0.05)。给予各组不同的干预后,模型组大鼠的体重与正常组相比仍明显降(P0.01);与模型组相比,电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组大鼠体重明显增加(均P0.01);电针+抑制剂组大鼠体重高于电针组(P0.05)及抑制剂组(P0.01);电针组与抑制剂组之间无明显差别(P0.05)。模型组大鼠胃内残留率明显高于正常组(P0.01);与模型组比较,电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组胃内残留率均明显下降(P0.01);电针+抑制剂组胃内残留率低于电针组(P0.05)、抑制剂组(P0.05);电针组与抑制剂组之间胃内残留率无明显差异(P0.05)。模型组大鼠小肠推进率明显低于正常组(P0.01);电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组小肠推进率均明显高于模型组(P0.01);电针组与抑制剂组之间无明显差异(P0.05);电针+抑制剂组小肠推进率高于电针组(P0.05)、抑制剂组(P0.05)。各组大鼠胃窦与十二指肠组织形态学改变比较。各组大鼠胃与十二指肠组织未发现器质性改变;剪开胃体及十二指肠洗净后,肉眼观察仅模型组胃黏膜颜色偏白,正常组、电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组胃组织黏膜未见溃疡、出血或炎症反应。3.电针对FD型大鼠ENS的影响与正常组相比,模型组大鼠胃窦与十二指肠组织PGP9.5蛋白表达显著减少(均P0.01);电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组三组胃窦PGP9.5蛋白表达较模型组均明显增加(P0.01,P0.05,P0.01),电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组三组十二指肠组织中PGP9.5蛋白表达的结果也同胃窦组织,高于模型组(均P0.01);电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织PGP9.5蛋白水平明显高于电针组(均P0.05)、抑制剂组(均P0.01);电针组胃窦与十二指肠组织PGP9.5蛋白水平高于抑制剂组(均P0.01)。免疫荧光染色可见,s100β染色阳性为红色荧光,主要分布于胃窦与十二指肠组织粘膜层及肌层,模型组染色更强,尤其是粘膜层荧光染色明显增加。同时半定量分析结果显示,模型组组胃窦与十二指肠组织s100β相对表达量显著高于正常组;与模型组比较,电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组大鼠胃窦与十二指肠组织中s100β相对表达量明显降低(均P0.01);电针组与抑制剂组之间无明显差别(均P0.05);而电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织s100β相对表达量低于电针组(均P0.05)、抑制剂组(均P0.05)。同时提取胃窦与十二指肠组织进行WB分析,如图3-3结果显示,模型组胃窦与十二指肠组织s100β蛋白表达水平较正常组上调(均P0.01);相对于模型组,电针组、抑制剂组,电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织s100β蛋白表达均下降(均P0.01),电针组与抑制剂组之间无明显差别(P0.05);而电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织s100β蛋白表达低于电针组(均P0.05)、抑制剂组(均P0.05)。模型组大鼠胃窦与十二指肠组织GFAP蛋白水平较正常组上升(均P0.01);电针组、抑制剂组,电针+抑制剂组大鼠胃窦(均P0.01)与十二指肠组织(P0.01,P0.05,P0.01)GFAP蛋白水平均明显下降;且电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织GFAP蛋白水平低于电针组(均P0.05)、抑制剂组(均P0.05);而电针组与抑制剂组两组之间不存在统计学差异(均P0.05)。各组大鼠胃窦与十二指肠组织PGP9.5 mRNA表达变化如下,模型组胃窦与十二指肠组织PGP9.5 mRNA水平显著低于正常组(均P0.01);与模型组比较,电针组组、抑制剂组、电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织PGP9.5 mRNA表达均明显上升(均P0.01);电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织PGP9.5 mRNA表达明显高于电针组(胃窦P0.05,十二指肠P0.01)、抑制剂组(均P0.01);电针组胃窦与十二指肠组织PGP9.5mRNA水平较抑制剂组明显上调(胃窦P0.01,十二指肠P0.05)。模型组胃窦与十二指肠组织s100βmRNA表达水平均较正常组显著升高(P0.01);与模型组比较,电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织s100βmRNA表达均明显下降(均P0.01);电针组胃窦与十二指肠组织s100βmRNA表达低于抑制剂组(胃窦P0.01,十二指肠P0.05),但高于电针+抑制剂组(均P0.01);与抑制剂组相比,电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织s100βmRNA表达减少(均P0.01)。各组大鼠胃窦与十二指肠组织GFAP mRNA水平变化如下。模型组胃窦与十二指肠组织GFAP mRNA表达水平均显著高于正常组(均P0.01);电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织GFAP mRNA表达较模型组明显下降(均P0.01);电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织GFAP mRNA表达明显低于电针组(胃窦P0.05,十二指肠P0.01)、抑制剂组(均P0.01);抑制剂组胃窦与十二指肠组织GFAP mRNA表达高于电针组(胃窦P0.05,十二指肠P0.01)。4.电针对FD型大鼠GDNF及受体的影响。各组胃窦及十二指肠组织GDNF免疫组化染色结果见图4-1,从图中可以发现,GDNF染色阳性为棕黄色阳性反应产物。正常组大鼠胃窦黏膜层与肌层均可见棕黄色阳性反应产物;正常组大鼠十二指肠的棕黄色产物主要分布在黏膜层。模型大鼠胃窦与十二指肠组织棕黄色阳性反应颗粒明显增加,尤其是黏膜层棕黄色反应物明显增加。通过半定量分析显示,FD模型大鼠胃窦与十二指肠组织的GDNF相对表达量显著高于正常组(均P0.01);与模型组相比,电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织的GDNF相对表达量明显降低(均P0.01)。电针+抑制剂组GDNF相对表达量低于电针组(胃窦P0.05,十二指肠P0.01)、抑制剂组(均P0.01);电针组与抑制剂组比较差异无统计学意义(均P0.05)。同时,我们采用WB对各组大鼠胃窦与十二指肠组织的GDNF蛋白表达进行分析,结果显示模型组大鼠胃窦与十二指肠组织的GDNF蛋白表达增加,高于正常组(均P0.01);与模型组比较,电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织GDNF蛋白表达显著低于模型组(均P0.01);电针组与抑制剂组两组比较,无明显差异(均P0.05);电针+抑制剂组大鼠胃窦与十二指肠组织GDNF蛋白水平明显低于电针组(均P0.05)及抑制组(均P0.05)。模型组大鼠胃窦与十二指肠组织的GFRα1蛋白水平显著高于正常组(均P0.01);与模型组相比,电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织的GFRα1蛋白水平显著下降(均P0.01);电针+抑制剂组大鼠胃窦与十二指肠组织GFRα1蛋白水平明显低于电针组(均P0.05)与抑制组(均P0.05);电针组与抑制剂组两组比较,无明显差异(均P0.05)。各组大鼠胃窦与十二指肠组织RET蛋白水平如下,模型组大鼠胃窦与十二指肠组织的RET蛋白水平显著高于正常组(均P0.01);与模型组相比,电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织的RET蛋白水平显著下降(均P0.01);电针+抑制剂组大鼠胃窦与十二指肠组织RET蛋白水平低于电针组(均P0.05)与抑制组(均P0.01);与电针组比较,抑制剂组大鼠十二指肠组织RET蛋白水平高于电针组,而大鼠胃窦组织RET蛋白水平电针组与抑制剂组之间无明显差异(均P0.05)。各组大鼠胃窦及十二指肠组织GDNF mRNA水平变化如下,模型组大鼠胃窦与十二指肠组织GDNF mRNA水平明显高于正常组(P0.01);与模型组比较,电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织GDNF mRNA水平均明显低于模型组(均P0.01);电针+抑制剂组大鼠胃窦与十二指肠组织GDNF mRNA水平低于电针组(均P0.01)及抑制剂组(均P0.01);而电针组与抑制剂组之间比较无统计学意义(均P0.05)。5.电针对FD型大鼠MEK/ERK信号通路的影响。与正常组比较,模型组大鼠胃窦与十二指肠组织pMEK蛋白水平均显著上调(均P0.01);与模型组比较,电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组大鼠胃窦与十二指肠组织pMEK蛋白水平均显著下降(均P0.01);电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织pMEK蛋白水平低于电针组(均P0.01)、抑制剂组(均P0.05);抑制剂组大鼠胃窦与十二指肠组织pMEK蛋白水平低于电针组(均P0.05)。与正常组比较,模型组大鼠胃窦与十二指肠组织pERK1/2蛋白水平均显著上调(均P0.01);电针组,抑制剂组,电针+抑制剂组大鼠胃窦与十二指肠组织pERK1/2蛋白水平均显著低于模型组(均P0.01);电针+抑制剂组胃窦与十二指肠组织pERK1/2蛋白表达低于电针组(均P0.01)、抑制剂组(均P0.05);与抑制剂组相比,电针组大鼠胃窦与十二指肠组织pERK1/2水平上升(均P0.05)。结论(1)FD模型大鼠胃窦与十二指肠组织神经元减少,EGCs异常增殖激活,EGCs超微结构受损。(2)电针增加FD大鼠体重,促进胃肠动力,同时还能改善FD大鼠一般情况。(3)电针能够促进受损的ENS的恢复,并且ERK信号通路抑制剂与电针联合使用,出现叠加效应,电针对ENS的恢复作用与ERK信号通路有关。(4)电针通过抑制FD模型大鼠MEK/ERK信号通路的激活,促进FD大鼠受损的ENS的恢复,是电针干预FD大鼠的可能作用机制之一。
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R245.97
【图文】：

2.2 各组大鼠胃窦与十二指肠组织 EGCs 超微结构的变化通过 TEM 观察 EGCs 的超微结构，显示神经纤维周围的正常 EGCs细胞结构（图 A,B），细胞呈不规则星形，胞核形态不规则，胞核中常染色质较多，异染色质较少，核周围分布有许多大小不等呈圆形或椭圆形的无髓神经纤维轴索，轴索附近含有少量的线粒体，还可见轴索中分布的神经丝，胞质中其他细胞器较少。受损的 EGCs 超微结构可见 EGCs 细胞核中异染色质增多（图 D,F,H），染色质浓缩（图 D,F,H），线粒体肿胀（图E,F,G,H），内质网扩张（图 C,D,E,F,G,H）。图 1-1 各组大鼠胃窦与十二指肠组织 PGP9.5、s100β、GFAP 蛋白相对表达量注：A；正常组；B：FD2 周组；C：FD3 周组；D：FD4 周组。与正常组组相比，△P<0.05，△△P<0.01；与 FD2 周组相比，%糚<0.05，%

本文编号：2775297