电针通过PTEN及ERK信号通路减轻大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的机制研究

发布时间：2020-07-30 20:40

【摘要】：第一部分电针刺激曲池(LI11)和足三里(ST36)穴位能够抑制缺血性脑卒中后神经细胞凋亡目的:探究在曲池(LI11)和足三里(ST36)穴位的电针治疗是否减少缺血性脑卒中后的神经细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。方法:72只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为3组:假手术组(sham)、大脑中动脉梗阻再灌注组(MCAO)、电针组(EA)。电针治疗部位是大鼠右侧患肢的曲池(LI11)和足三里(ST36)穴位,在大脑中动脉梗阻24h后开始,每日1次,连续3天。缺血再灌注72h后进行神经功能缺损评估,随后每组各取6只大鼠进行TTC染色评估脑梗死体积,每组各取6只大鼠进行TUNEL染色来比较每组TUNEL阳性细胞百分比,每组各取6只大鼠用于western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3,Cleaved caspase-3,Bim,Bcl-2的表达,其余大鼠用于免疫组化检测分析Caspase-3,Bim,Bcl-2的表达。结果:缺血再灌注72h后,MCAO组神经功能缺损评分明显高于sham组(P0.01),而EA组神经功能缺损程度低于MCAO组(P0.05)。假手术组大鼠无脑梗死体积。而MCAO组大鼠脑梗死体积明显高于EA组(P0.05)。MCAO组TUNEL阳性细胞数量百分比明显高于sham组(P0.01)。EA组较MCAO组TUNEL阳性细胞数量百分比明显减少(P0.01)。western blot检测结果表明,MCAO组的caspase-3(P0.05)、cleaved-caspase-3(P0.01)、Bim(P0.01)表达量高于sham组,Bcl-2(P0.01)表达量低于sham组;而EA组caspase-3(P0.05)、cleaved-caspase-3(P0.01)、Bim(P0.01)表达水平低于MCAO组,Bcl-2表达高于MCAO组(P0.05)。免疫组化检测结果表明,电针治疗显著抑制了缺血性脑损伤导致的大脑皮层caspase-3、cleaved-caspase-3、Bim的阳性细胞数量的升高,逆转了缺血性脑损伤所致Bcl-2阳性细胞数量的下调(P0.01)。结论:电针刺激曲池(LI11)和足三里(ST36)这两个穴位能够降低I/R大鼠的神经功能缺损评分,减少脑梗阻面积和大脑皮层细胞的凋亡。说明电针能够抑制缺血性脑卒中后的神经细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。第二部分电针刺激曲池(LI11)和足三里(ST36)穴位能够调节PTEN,ERK信号通路目的:探究以曲池(LI11)和足三里(ST36)为刺激穴位的电针治疗是否能通过PTEN,ERK信号通路和Midkine(MK)发挥神经保护作用。方法:36只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为3组:假手术组(sham)、大脑中动脉梗阻再灌注组(MCAO)、电针组(EA)。电针治疗部位是右侧患肢的曲池(LI11)和足三里(ST36)穴位,在大脑中动脉梗阻24h后开始,每日1次,连续3天。局部脑缺血再灌注72h后每组各取6只大鼠用于western blot检测p-PTEN,p-PDK1,p-GSK-3β,Thr308,Ser473,tAkt,MK,p-ERK1/2,p-JNK,p-P38,ERK1/2,JNK,P38蛋白的表达;每组各选6只大鼠用于免疫组化检测MK的表达。结果:MCAO组p-PTEN、Ser473表达水平较sham组显著增加,而Thr308、p-PDK1和p-GSK-3β水平较sham组显著降低(P0.01)。然而,在EA组与MCAO组相比,p-PTEN、Ser473的表达水平明显降低(P0.01),p-PDK1、p-GSK-3β、Thr308的表达水平明显增高(P0.01)。t-Akt蛋白水平在三组之间无明显差异(P0.05)。MCAO组p-ERK1/2、p-P38、p-JNK的蛋白表达量较Sham组明显升高(P0.01)。而EA组的p-ERK1/2(P0.01)、p-JNK(P0.05)、p-P38(P0.05)的表达高于MCAO组。三组间ERK1/2、JNK、P38表达无差异(p0.5)。western blot和免疫组化分析显示,三组间MK表达水平存在显著差异。MCAO组(P0.01)和EA组(P0.01)MK的表达均较sham组明显升高。EA组大鼠MK水平明显高于MCAO组(P0.01)。结论:大鼠脑缺血再灌注损伤后,电针刺激曲池(LI11)和足三里(ST36)穴位可通过影响PTEN和ERK信号通路及MK的表达,从而发挥神经保护作用。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R245.97
【图文】：

Fig .1 EA decreases neurological behavioral scores. A: Neurological deficassessment at 2 h after I/R injury；B: Neurological deficits assessment at 72after I/R injury (n = 6 rats/group).There was no significant difference neurological scores between the MCAO group and EA group at 2 h followinI/R surgery (P>0.05), as shown in Fig 1A. However, the neurological deficiof the rats in the EA group were significantly decreased at 72 h after I/R inju(P<0.05) as shown in Fig 1B. ** P< 0.01 vs the sham group; #P<0.05 vs thMCAO group.2. 电针治疗减少局部脑缺血的梗阻体积:在 I/R 损伤 72 小时后进行梗死体积评估。如图 2 所示，Sham 组大鼠脑组织无缺血区域，但 EA 组与 MCAO 组之间脑梗死体积有显著差异。MCAO 组大鼠梗死体积明显高于 EA 组(P<0.05)。说明电针可以减少脑梗死体积，发挥神经保护作用。Sham MCAO EA

3. 电针治疗可减轻脑缺血大鼠的神经细胞凋亡为了研究电针干预对细胞凋亡的影响，我们采用 TUNEL 染色来评估凋亡细胞的数量。如图 3 所示,与 Sham 组相比，MCAO 组 72h 后凋亡细胞数量明显升高(P<0.01)。与 MCAO 组相比，电针干预降低了凋亡细胞数量(P<0.01)。说明电针治疗可以抑制细胞凋亡，发挥神经保护作用。MCAOSham

为进一步探讨电针的神经保护作用机制，采用免疫组织化学染色检测亡相关蛋白 caspase-3，Bim，Bcl-2 的表达，采用 western blot 技术检测aspase-3、cleaved-caspase-3、Bim、Bcl-2 的蛋白表达。如图 4 所示，足里和曲池穴的电针治疗明显减少神经细胞凋亡。电针治疗显著降低了缺性卒中引起的 caspase-3（P<0.05）、cleaved-caspase-3（P<0.01）和 BimP<0.01）的上调，逆转了 Bcl-2（P<0.05）的下调。如图 5 所示，与 Sham相比，MCAO 组缺血的大脑皮层 caspase-3、Bim 阳性细胞比例增加，cl-2 阳性细胞比例减少（P<0.01）；而 EA 组大脑皮层 caspase-3 和 Bim性细胞数量减少，Bcl-2 阳性细胞数量增加（P<0.01），上述结果表明针治疗能够通过调节凋亡相关蛋白的表达来抑制缺血性脑卒中后神经胞凋亡。Sham MCAO EA

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本文编号：2776054