基于AMPK信号通路探究肺瘤平膏调控自噬影响肺癌进展的效应机制

发布时间：2020-08-01 20:08

【摘要】：研究意义:肺癌是世界上发病率最高,并且癌因死亡率最高的恶性肿瘤。目前的治疗手段主要包括:手术、化疗、放疗、靶向治疗以及免疫治疗。近40年随着治疗技术的提高,肺癌1年生存率从34%提升到45%。但治疗手段(如:化疗)引起的消化道反应和骨髓抑制,严重影响患者的生存质量,因此进一步探究肺癌的发生发展机制,并发现副作用小疗效好的治疗方法具有重要意义。自噬主要受AMPK和mTOR信号通路调控,在肺癌发生发展中是一柄“双刃剑”。一方面,自噬可以有效清除细胞内的毒性产物,阻止肺癌发生;另一方面,自噬可以为应激状态下的肺癌细胞提供能量供应,促进肺癌细胞存活。肺瘤平膏(FLP)是治疗肺癌的有效方剂,具有益气养阴、化痰散结、解毒活血的功效。前期研究表明,FLP可以通过抑制肺癌细胞生长,并且可以抑制AKT表达,而AKT-mTOR是调控自噬的关键通路。所以,我们推测FLP可以调控自噬影响肺癌的进展。研究目的:明确FLP通过AMPK信号通路调控自噬影响肺癌进展的相关机制。研究方法:(1)采用人肺腺癌A549细胞系,接种到BALB/C裸鼠右侧腋下,建立荷瘤小鼠模型,用生理盐水、FLP干预14d、21d以及35d,测量瘤体重量,计算抑瘤率。用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)方法检测肿瘤组织增殖相关Ki-67的表达情况。(2)A549肺癌荷瘤小鼠,用生理盐水、FLP、Metformin(Met)、Met+FLP、Chloroquine(CQ)以及FLP+CQ干预14d、21d以及35d,用Western Blotting(WB)和IHC方法检测肿瘤组织中自噬相关蛋白LC3、ULK1、P-ULK1、Beclin1、ATG3、ATG5、ATG7以及P62的表达水平。(3)A549肺癌荷瘤小鼠,用生理盐水、FLP、Metformin(Met)、Met+FLP干预14d、21d以及35d,用WB和IHC方法检测肿瘤组织中LKB1、AMPK、P-AMPK、mTOR和P-mTOR蛋白的表达水平。(4)A549肺癌荷瘤小鼠,用生理盐水、FLP、Metformin(Met)、Met+FLP干预14d、21d以及35d,用WB和IHC方法检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、XIAP、Survivin以及细胞周期蛋白Cyclin D1的表达水平。(5)用人急性单核细胞白血病细胞系(THP-1),诱导成巨噬细胞,和A549细胞体外建立共培养模型,模拟肿瘤生长炎性微环境,用WB方法检测自噬相关蛋白LC3、ULK1、P-ULK1、ATG3的表达水平。(6)用WB方法检测共培养体系中A549细胞LKB1、AMPK、P-AMPK、mTOR和P-mTOR蛋白的表达水平。(7)用ELISA方法检测A549共培养模型中细胞上清液炎性因子TNF-α、IL-1β以及IL-6的水平。研究成果:(1)FLP可以抑制A549荷瘤小鼠肿瘤组织的生长,并且随着干预时间的延长抑瘤率逐渐增加,35d大于21d,21d大于14d,抑瘤率从高到低分别为:40.7%,29.3%以及8.8%。在肿瘤增殖相关指标Ki-67表达方面,FLP组表达低于Model组,并且14d和35d具有统计学意义(P0.001)。(2)在14d、21d以及35d时,WB结果显示:FLP组肿瘤组织中自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均高于Model组,并且ULK1、P-ULK1、Belin1、ATG3、ATG5和ATG7表达较Model组均有不同程度的升高,P62表达低于Model组;Met和FLP+Met组蛋白表达情况和FLP组相一致。IHC结果各蛋白表达情况和WB结果一致。结果提示:FLP可以上调A549荷瘤小鼠肿瘤组织的自噬水平。(3)WB结果显示:在14d、21d以及35d时,FLP组、Met组和FLP+Met组肿瘤组织中LKB1、AMPK和P-AMPK蛋白表达高于Model组;14d和21d时,FLP组mTOR和P-mTOR表达低于Model组;35d时,FLP组mTOR和P-mTOR表达高于Model组。IHC结果方面,FLP组在LKB1、AMPK以及P-AMPK表达方面同WB结果一致,而FLP组P-mTOR表达在3个时间点均低于Model组。结果提示:FLP可以上调A549荷瘤小鼠肿瘤组织AMPK信号通路活性,抑制mTOR信号通路活性。(4)在14d、21d以及35d时,WB结果显示:FLP组肿瘤组织中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3表达高于Model组;凋亡抑制蛋白XIAP、Survivin表达低于Model组;细胞周期蛋白Cyclin D1低于Model组。并且IHC结果与WB结果相一致。Met为AMPK激动剂,活化的AMPK可以促进自噬依赖性的细胞凋亡,结合实验三的结果FLP可以上调AMPK水平,本实验FLP组和Met组结果均可以促进细胞凋亡。结果提示:FLP可能通过上调AMPK信号通路,促进细胞凋亡,阻滞细胞周期。(5)体外共培养模型中,WB结果显示,FLP含药血清组(CO-FLP)A549细胞中自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、P-ULK1和ATG3均高于空白血清组(CO-NRS)。结果提示:FLP含药血清可以上调共培养模型中A549细胞的自噬水平。(6)体外共培养模型中,WB结果显示,CO-FLP组A549细胞中LKB1、P-AMPK均高于CO-NRS,而P-mTOR蛋白低于CO-NRS组。结果提示:FLP可以上调共培养模型中A549细胞AMPK信号通路活性,抑制mTOR信号通路活性。(7)含药血清在24h和48h可以不同程度降低A549和THP-1巨噬细胞共培养模型细胞上清液炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6水平。结果提示:FLP含药血清可以改善肿瘤微环境中的炎性状态。结论及意义:基于本实验条件下,我们推测:(1)FLP可以抑制A549荷瘤小鼠肿瘤组织的生长和增殖;(2)FLP可能通过调控AMPK和mTOR信号通路,从而上调A549细胞自噬水平;(3)FLP可能通过上调AMPK信号通路促进A549荷瘤小鼠肿瘤组织细胞凋亡、阻滞细胞周期;(4)FLP可能改善肿瘤微环境的炎性状态。本结果为FLP防治肺癌提供了新的理论依据,但仍需更加严谨的基础及临床研究验证。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R273
【图文】：

自噬,信号通路,相关信号,苏氨酸蛋白激酶

■逡逑Ｒａｐａｍｙｄｎ逦ＣｌａｓｓＩＰＩ３Ｋ逡逑图２．自噬相关信号通路逡逑２．１邋ｍＴＯＲ信号通路逡逑ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ），一种丝氨酸－苏氨酸蛋白激酶，由丨１８】。

共培养,自噬,相关蛋白,细胞

３．１邋ＴＨＰ－１诱导成巨噬细胞逡逑ＴＨＰ－１细胞为悬浮细胞，球形。经ＰＭＡ诱导２４ｈ后，变为聚集成团，贴壁生长，逡逑并出现伪足。见图７．１。逡逑ｍｍ逡逑ＴＨＰ－１诱导前逦ＴＨＰ－１诱导后逡逑图７．１邋ＰＭＡ诱导ＴＨＰ－１细胞为巨噬细胞前后对比图（１００ｘ）逡逑３．２共培养条件下Ａ５４９细胞自噬相关蛋白的表达逡逑ＷＢ方法结果显示，共培养４８ｈ后，ＦＬＰ含药血清组（ＣＯ－ＦＬＰ）邋Ａ５４９细胞中ＬＣ３逡逑ＩＩ／ＬＣ３邋Ｉ邋比值高于邋Ａ５４９＋ＮＲＳ邋和邋ＣＯ－ＮＲＳ，３邋组比值依次为邋０．７６±０．０３、０．５７±０．１０邋和逡逑０．６６士０．０９；邋Ｐ－ＵＬＫ１蛋白和ＡＴＧ３蛋白方面，均是ＣＯ－ＦＬＰ高于另外两组，ＣＯ－ＦＬＰ组：逡逑Ｐ－ＵＬＫ１相对光密度值为０．８５±０．１３；邋ＡＴＧ３相对光密度值为１．１１±０．１３，具体见表７．１和逡逑图邋７．２。逡逑表７．１邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测共培养条件下Ａ５４９细胞自噬相关蛋白相对光密度值（Ｍｅａｎ邋±邋ＳＤ）逡逑组别逦Ａ５４９＋ＮＲＳ逦ＣＯ－ＮＲＳ逦ＣＯ－ＦＬＰ逡逑ＬＣ３邋ＩＩ／ＬＣ３邋Ｉ逦０．５７士０．１Ｕ逦０．６６±０．０９逦０．７６土０．０３逡逑ＵＬＫ１逦０．８７±0．0８逦０．８２±０．１５逦０．８０±０．０５逡逑Ｐ－ＵＬＫ１逦０．５７邋士邋（）．１（＞