特发性肺纤维化中医证候研究及右归饮干预肺纤维化大鼠的实验研究

发布时间：2020-08-13 09:53

【摘要】：特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种慢性不可逆,具有较高发病率和死亡率的呼吸系统疾病,目前尚缺乏有效的治疗途径和方法。近年来中医药治疗IPF不断显现出一定的优势和特色,但仍需要更多的理论研究、临床及实验研究数据的支撑。右归饮出自《景岳全书》,是温补肾阳的代表方剂,在既往的临床实践中,发现该方能在缓解IPF患者临床症状及提高生活质量等方面取得良好的疗效,但其疗效作用机制有待进一步探讨。故本课题拟通过分析IPF中医证候分布特点,明确“肾虚”在肺纤维化发病中发挥的作用,进一步设计动物实验对右归饮治疗肺纤维化的疗效进行评价,并探讨其作用机制,为临床诊治提供参考依据。研究目的1、探析特发性肺纤维化的证候分布特点用横断面研究方法,对137例IPF患者的临床资料进行统计分析,探析IPF患者中医证候分布特点,并进一步对“肺肾两虚”相关证型患者中医证候类型与相关影响因素、理化指标进行相关性分析,明确“肺肾相关”理论与肺纤维化发病的重要关联,同时为下一步基础实验研究提供辨证遣方启示。2、研究右归饮对特发性肺纤维化的疗效机制基于“肺肾相关”理论,探究右归饮对博莱霉素诱导肺纤维化模型大鼠的干预作用,并从PGE2受体调控炎症反应、内质网应激介导细胞凋亡两个角度探讨右归饮治疗肺纤维化的作用机制。研究方法1、临床研究选取符合纳排标准的IPF患者,采用SPSS 24.0统计分析软件对患者临床资料进行分析,统计患者中医证型分布特征;将与肺肾亏虚相关证型合并为“肺肾两虚证”,以Logistic回归分析方法,探究肺肾两虚型IPF患者证候与临床特征、理化指标之间的相关性。2、实验研究通过气管插管并给予博莱霉素雾化建立实验性肺纤维化大鼠模型,在模型建立后,随机分为模型组、吡非尼酮组、右归饮低剂量组(右低组)、右归饮高剂量组(右高组),并取同数量正常大鼠作为正常对照,于造模后第14天开始,正常组、模型组给予等量饮用水灌胃,吡非尼酮组、右高组、右低组分别予相应药物灌胃,共干预20天。干预结束后,对大鼠进行肺功能检查,取动脉血进行血气分析,留取肺脏组织。HE染色及Masson染色法观察肺组织病理变化;酸水解法检测羟脯氨酸含量;ELISA法检测大鼠血清及肺组织PGE2水平;免疫组织化学染色法观察肺组织中EP2、EP3的分布及表达情况;Western Blot法检测肺组织CHOP、GRP78、Caspase-3蛋白表达情况;实时荧光定量PCR法检测肺组织CHOP、GRP78mRNA表达情况。研究结果1、临床研究本研究共纳入137例IPF患者,其中肺肾气虚证所占比例最高(29.93%),其次为肺肾气阴两虚证、痰热蕴肺证、痰浊阻肺证、肺气虚证、阴虚内热证;肺肾气虚、肺肾气阴两虚患者年龄分布偏大;肺肾气阴两虚证患者FVC%显著低于痰热蕴肺证、痰浊阻肺证、阴虚内热证(p0.05),肺肾气虚证患者DLCO%水平低于痰热蕴肺证、痰浊阻肺证、阴虚内热证(p0.05);肺肾气虚证Pa02水平低于肺气虚证、痰热蕴肺证、痰浊阻肺证(p0.05);Logistic回归分析结果得出年龄50岁、男性与肺肾两虚证型具有显著相关性(p0.05),FVC%、Pa02与肺肾两虚证呈负相关,FVC%、PaI2越低,诊断为肺肾两虚的可能性越大。2、实验研究(1)肺组织形态学:正常组大鼠肺脏组织结构正常,模型组肺泡结构紊乱,间质中伴有大量炎性细胞浸润,可见大量胶原纤维沉积,右归饮治疗组能不同程度抑制肺组织实变区向非实变区的炎性浸润,并减少胶原沉积。(2)肺脏HYP含量:与正常组大鼠比较,模型组HYP水平显著升高(p0.05);与模型组比较,右高组、吡非尼酮组HYP水平下降(p0.05)。(3)肺功能及血气分析:与正常组大鼠比较,模型组大鼠FVC、FEF25%、FEF50%、FEF75%、MMF 水平显著降低(p0.05),FEV0.4/FVC%水平明显升高(p0.05);与模型组比较,吡非尼酮组、右低组、右高组FVC水平均明显升高(p0.05);右低组能提高模型大鼠的FEF25%、FEF50%、FEF75%、MMF水平(p0.05);各组大鼠血气分析指标均未见显著性差异(p0.05),但右归饮高组与模型组相比,P02与S02均呈现升高趋势。(4)肺脏质量及肺脏系数:与正常组比较,模型大鼠肺脏质量、肺脏系数病理性升高(p0.05)。右低组与模型组相比,肺脏质量、肺脏系数下降(p0.05)。(5)血清和肺组织中PGE2水平:与正常组大鼠相比,模型组大鼠血清和肺组织中的PGE2水平均升高(p0.05);与模型组大鼠相比,右低组大鼠血清和肺组织的PGE2水平均降低(p0.05),右高组大鼠血清中的PGE2水平降低(p0.05)。(6)EP2、EP3分布及表达情况:正常组大鼠肺组织中仅有极少数着色的EP2阳性细胞,未见表达EP3阳性的细胞;模型组大鼠实变区肺组织中AECIIs呈EP2强阳性表达,肺泡管和肺泡腔内则可见大量聚集的呈EP3阳性染色的巨噬细胞,与正常组比较,模型组EP2阳性和EP3阳性的细胞数均显著增加(p0.05);右低组大鼠实变区的肺组织中EP2呈弱阳性表达,EP3阳性的巨噬细胞比例明显增加,右高组EP2阳性程度有所增强,EP3阳性程度与模型组接近;与模型组比较,右低组EP2阳性的细胞数减少(p0.05),EP3阳性的细胞数增加(p0.05),而右高组未见统计学差异。(7)CHOP、GRP78蛋白表达及mRNA转录:与正常组比较,模型组大鼠肺组织中CHOP、GRP78蛋白表达明显上调(p0.05);与模型组相比,右高组CHOP、GRP78蛋白表达明显降低(p0.05);模型组大鼠肺组织中CHOP、GRP78mRNA表达较正常组有升高趋势。与模型组相比,右高组CHOP mRNA表达下调,但无统计学差异,各治疗组GRP78mRNA表达有下降趋势。(8)Caspase-3蛋白表达:与正常组相比,模型组大鼠肺组织中Caspase-3蛋白表达升高(p0.05);与模型组相比,右高组大鼠肺组织Caspase-3蛋白表达下降,差异有统计学意义(p0.05)。研究结论1、肺肾气虚是特发性肺纤维化主要证候,且该病常伴肾阳虚症状肺肾气虚是IPF最常见的中医证型,且肺肾气虚证患者中多伴有肾阳虚症状,此外各证型中多兼夹瘀血证,该病关键病机可以概括为“虚、痰、瘀”,虚则主要责之肺肾,肺肾虚损是IPF发病的重要基础,IPF证候特点提示从补肾温阳治疗IPF将取得良好疗效。2、肺肾两虚多伴肺功能下降肺肾气虚及肺肾气阴两虚患者多存在于老龄患者。肺肾气阴两虚患者多存在FVC下降,肺肾气虚证患者多存在DLCO%与PaO2下降。年龄50岁、男性的IPF患者更容易出现肺肾两虚证型,FVC%、PaO2降低与肺肾两虚证具有显著的相关性。3、右归饮可通过调节前列腺素E2及改善内质网应激介导的细胞凋亡而延缓病程右归饮可一定程度改善肺纤维化模型大鼠通气功能障碍,改善肺泡气体交换功能,降低肺组织炎性浸润及胶原沉积情况,其机制可能与降低肺组织中PGE2的水平,抑制AECIIs中EP2的表达,减少EP2阳性的AECIIs数量,增加EP3阳性的肺泡巨噬细胞数量,减轻肺脏炎性损伤,调控内质网相关蛋白GRP78、CHOP的表达,改善ERS,减少细胞凋亡相关。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R259;R285.5
【图文】：

右归饮,HE染色,亮蓝,气道

图１右归饮对大鼠肺组织ＨＥ染色的影响（ｘｌ00）逡逑注：Ａ正常组、Ｂ模型组、Ｃ吡非尼酮组、Ｄ右归饮低剂量组、Ｅ右归饮高剂量组标尺＝５０邋ｐｍ逡逑３．１．２各组大鼠月市组织Ｍａｓｓｏｎ染色逡逑Ｍａｓｓｏｎ染色结果显示，除外气道和血管的管壁，正常组肺间质中几乎未见亮蓝染色逡逑的胶原纤维沉积；模型组气道周围的肺实变区和增厚的肺泡间隔，内可见大量亮蓝着色逡逑

右归饮,实变,胶原,组标

的胶原纤维沉积；吡非尼酮组可见实变区内亮蓝着色的胶原区域明显减少；右归饮低剂逡逑量组胶原着色的实变区占比有所减少；右归饮高剂量组胶原着色的实变区占比明显减少，逡逑且实变区和肺泡隔中蓝染的胶原沉积也显著改善，见图２。逡逑？壚逡逑ｍｍ逡逑７１逡逑

右归饮,肺组织,含量影响

胶原纤维沉积明显增多；吡非尼酮、右高组与正常组比较。ＨＹＰ含量均未见显著差异（／＞逡逑＞０．０５）。与模型组比较，右低组ＨＹＰ改变不明显（ｐ＞０．０５），而右高组、吡非尼酮逡逑ＨＹＰ水平明显减少，差异有统计学意义（／？＜０．０５），见表１５，图３。逡逑表１５右归饮对肺组织ＨＹＰ含量的影响（ｆ±‘ｓ＇）逡逑Ｍ逦剂量（ｇ／ｋｇ）逦Ｎ逦ＨＹＰ邋含量（ｕｇ／ｍｌ）逡逑正常组逦－逦８逦５．５７±２．３２逡逑模型组逦０．０５逦７逦８．９９±１．８５＊逡逑吡非尼酮组逦５逦８逦７．０１±１．４９＃逡逑右低组逦１０逦８逦７．５５±１．８８’逡逑右高组逦８逦６．７４±１．５０＃逡逑Ｆ邋值逦３．４４８逡逑尸值逦０．０１８逡逑注：与正常组相比，＞＜０．０５；与模型组相比，＃ｐ＜０．０５。逡逑７２逡逑

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