针灸干预对克罗恩病模型大鼠肠道菌群多样性的影响

发布时间：2020-10-24 03:40

　　 目的:本实验采用三硝基苯磺酸(TNBS)对SD大鼠进行灌肠造模,成功制备克罗恩病(CD,Crohn's disease)模型后,观察针刺与艾灸对CD大鼠肠道菌群变化的调节。对肠道菌群Alpha多样性、门水平菌群的结构组成、科水平中特定差异性物种进行对比分析。探讨针刺与艾灸对CD的治疗与肠道菌群发生的关系,为针灸临床防治CD提供有利的实验依据。方法:选用随机分组的方法将32只SD大鼠分为四组,分别为HE(空白组)、HA(模型组)、HB(针刺组)、HC(艾灸组),参照Morris2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)方法制备CD肠纤维化大鼠模型。造模成功后,对针刺组、艾灸组大鼠进行干预,操作穴位选取“天枢穴”、“上巨虚穴”,每日治疗1次,每次治疗15分钟,共治疗7天。空白组与模型组采用相同的方法固定15分钟,但不做针刺与艾灸等其他治疗。实验期间记录大鼠的体重、粪便性状、便血情况、大鼠疾病活动指数(DAI)的计算,治疗结束后,对大鼠粪便进行采集,运用16S rDNA高通量测序方法对32例大鼠肠道微生物样本进行分析。收集大鼠结肠标本,肉眼及生物显微镜下观察四组大鼠的结肠病理变化。结果:1通过TNBS诱导大鼠,CD造模成功后,CD模型大鼠出现毛发干枯、懒动、体重下降、厌食等情况,可见松散便、稀便及血便,DAI评分明显增高,通过针刺与艾灸治疗后,大鼠体重较模型组增加,粪便性状,便血等情况较模型组改善,DAI评分显著下降(P﹤0.01)。2肉眼观察大鼠结肠形态:空白组大鼠结肠形态正常,肠粘膜无充血水肿,质软,颜色淡红,肠壁较薄,为正常的组织。模型组大鼠肠壁形态不规则,肠粘膜附着对侧粘膜形成溃疡,充血水肿,肠壁黏连,肠壁增厚,可见糜烂、出血及溃疡,肠粘膜高度水肿,成块状增厚,如息肉状。针刺、艾灸治疗后结肠形态较模型恢复,粘膜较模型光滑,局部充血、水肿等现象明显减轻,肠壁变薄,未见明显溃疡糜烂面。3生物显微镜下观察四组大鼠结肠病理变化:与空白组比较,模型组大鼠结肠组织层次模糊,结构混乱,肠粘膜充血水肿,结肠腺体弯曲变形,杯状细胞坏死脱落,隐窝畸形并有肠壁全层出现炎症细胞浸润,呈透壁性炎症反应,粘膜肌层增厚。经针刺与艾灸治疗后,肠粘膜结构较完整,肠组织层次较清晰,结肠腺体结构恢复,肠粘膜肌层增厚改善,炎症细胞浸润、充血水肿现象较模型组明显改善。4肠道菌群16S rDNA高通量测序结果:多样性分析:CD模型组大鼠较空白组肠道菌群多样性及丰度减少,而针刺与艾灸治疗后,肠道菌群的多样性及丰度恢复(P﹤0.05或P﹤0.01)。稀释性曲线分析:以Chao1、Observed species、Shannon和Simpson指数构建的稀释曲线结果表明:随着测序数据量的增加,OTU水平下的Chao1、Observed species、Shannon和Simpson指数增加,当测序数据量达到一定的数值后,丰度及多样性指数减小,曲线趋于平坦。群落组成与显著性差异分析:在门水平对群落进行结构分析发现,模型组大鼠厚壁菌门与拟杆菌门减少,而变形菌门增加,通过针刺与艾灸治疗后,拟杆菌门明显上升,变形菌门明显下降。在科水平进行物种差异显著性分析发现肠杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌均存在显著差异,主要表现为模型组大鼠肠杆菌显著上升(P﹤0.01),而拟杆菌与乳酸杆菌显著下降(P﹤0.01),针刺与艾灸治疗后,肠杆菌明显降低(P﹤0.01),拟杆菌与乳酸杆菌升高,艾灸升高显著(P﹤0.05)。结论:1针灸能改善TNBS诱导的CD模型大鼠的一般状况、DAI评分及病理变化。2针灸对肠道菌群的失调具有良好的调节作用,其中拟杆菌、肠杆菌以及乳酸杆菌可能为针灸治疗CD的关键细菌。
【学位单位】：湖南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R245
【部分图文】：

图 1. 测序实验流程图 提取与质检步骤剂盒抽提粪便样本的基因组 DNA，用 1.5%的琼纯度、完整性进行检测。 扩增实验（荧光定量）好、覆盖率较高 341F 和 806R 引物对 16SV3-V物对 16SV4 区进行扩增，合成带有 barcode 序列增；电泳检测，DNA 回收纯化，荧光定量，进表 1.3 PCR 引物引物名称 引物序列 341F 5’- CCTACGGGNBGCASCAG806R 5’- GGACTACNVGGGTWTCTA

图 2 四组大鼠体重比较1.2 大鼠 DAI 评分DAI 评分结果显示：造模结束后，针刺与艾灸组的 DAI 评分与模型组接近，表明三组无明显差异（P>0.05），治疗后，针刺与艾灸治疗组的 DAI 评分明显降低（P﹤0.01）。 说明针刺与艾灸治疗能减轻模型组大鼠的炎症反应，促进克罗恩病的恢复（如表 2.1、图 2.1）。表 2.1 针灸治疗前后大鼠疾病活动指数评分（DAI）（Mean±SD）组别 造模后 治疗后空白组模型组 2.33±1.01 2.21±0.78针刺组 2.29±0.98 0.96±0.88**艾灸组 2.25±0.83 1.08±0.92**注：与模型组比较，**P﹤0.01

图 2.1 大鼠 DAI 评分指数对比2 病理组织学改变2.1 各组大鼠结肠形态肉眼观察肉眼观察大鼠结肠形态，空白组大鼠结肠形态正常，肠粘膜无充血水肿，质软，颜色淡红，肠壁较薄，为正常的组织。模型组大鼠肠壁形态不规则，肠粘膜附着对侧粘膜形成溃疡，充血红肿，肠壁黏连，肠壁增厚，可见糜烂、出血，肠粘膜高度水肿，成块状增厚，如息肉状（见图中箭头所示）。针刺、艾灸治疗后结肠形态较模型恢复，粘膜较模型光滑，局部充血、水肿等现象明显减轻，肠壁变薄，未见明显溃疡糜烂面。见图 2.2。
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本文编号：2853965