大鼠肝郁脾虚证的代谢组学研究 59

发布时间：2016-05-18 09:21

本文关键词：大鼠肝郁脾虚证的代谢组学研究，由笔耕文化传播整理发布。

；中西医结合学报２００７年５月第５卷第３期Jour；·３０７·；大鼠肝郁脾虚证的代谢组学研究；罗和古，丁杰，岳广欣，陈家旭；北京中医药大学中医诊断系，北京１０００２９；目的：研究慢性束缚应激大鼠（肝郁脾虚模型）的血浆；方法：选用实验用二级雄性SD大鼠２４只，随机分为；NMR）波谱仪检测；０．０４ppm，进行分段积

中西医结合学报２００７年５月第５卷第３期　JournalofChineseIntegrativeMedicine，May２００７；Vol．５，No．３

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大鼠肝郁脾虚证的代谢组学研究

罗和古，丁杰，岳广欣，陈家旭

北京中医药大学中医诊断系，北京１０００２９

目的：研究慢性束缚应激大鼠（肝郁脾虚模型）的血浆代谢表型改变，开展中医证候学的研究，试图通过对慢性束缚应激大鼠代谢物组的共性分析和生物标记物的发现，寻找肝郁脾虚证候的生物学本质，探讨代谢组学在中医证候学研究中的应用。

方法：选用实验用二级雄性SD大鼠２４只，随机分为４组：７d正常对照组（A组）、２１d正常对照组（B组）、７d模型组（C组）和２１d模型组（D组），每组６只。以慢性束缚方法制作应激大鼠模型。分别于第８天和第２２天麻醉后心室取血，用VarianUnityInova６００M超导傅立叶变化核磁共振（nuclearmagneticresonance，程序将H谱按默认值，分别从４．５～０．５ppm（弛豫时间编辑）以及６．０～０ppm（扩散编辑），每段为

１

NMR）波谱仪检测。自由感应衰减信号经过３２k傅立叶变换转为一维NMR谱图。调用VNMR软件中的

０．０４ppm，进行分段积分，将积分数据归一化后，以文本文件或Excel文件贮存，用于模式识别分析。将上述得到的数据文件利用SimcaP１０．０软件包进行主成分分析。

结果：大鼠血浆１HNMR谱的主成分分析，各组动物代谢谱各不相同，与已知应激状态下动物体内代谢的调未知化合物的谱峰峰形改变较为明显。这些发生改变的代谢物可以作为肝郁脾虚证的生物标志物做进一步的研究。

物，阐释中医证候的生物学本质。代谢组学分析是一种有良好发展前景的中医证候学研究方法。关键词：代谢组学；模式识别；核磁共振；中医；大鼠

中图分类号：R２５；文献标识码：A；文章编号：１６７２１９７７（２００７）０３０３０７０７

结论：各组大鼠血浆HNMR代谢谱之间存在差异，而且可能从代谢组学分析中找出特异的标志性代谢产

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节过程及结果相一致。正常对照组与模型组相比较发现，醋酸、乳酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和３．４４ppm的

Metabonomicstudyofsyndromeofliverqistagnationandspleendeficiencyinrats

HeguLUO，JieDING，GuangxinYUE，JiaxuCHEN

DepartmentofDiagnosticsofTraditionalChineseMedicine，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing１０００２９，China

Objective：Todeterminethechangesoftheplasmametabolicphenotypeinratswithchronicrestraintstress（ratswithsyndromeofliverqistagnationandspleendeficiency），soastorevealthebiologicalfeaturesofthesyndromeofliverqistagnationandspleendeficiency，andtoexaminepotentialapplicationofmetabonomicanalysisinstudiesofsyndromesintraditionalChinesemedicine．

Methods：TwentyfourmaleSpragueDawleyratswererandomlydividedintofourgroups：groupA，７dnormalcontrolgroup；groupB，２１dnormalcontrolgroup；groupC，７dstressgroup；andgroupD，２１dstressgroup，with６ratsineachgroup．Chronicrestraintwasusedtoinducestressinrats．Bloodwascollectedfromthecardioventricleunderanesthesiaonthe８th（groupsAandC）or２２ndday（groupsBandD）anddetectedbyusingtheFouriervariablesuperconductingnuclearmagneticresonance（NMR）spectrometer（VarianUnityInova６００M）．FreeinductiondecaysignalsweretransferredintoonedimensionalNMRspectrogramvia３２kFouriertransformation．Segmentalintegralcalculus（０．０４ppmpersegment）wasperformedfrom４．５０．５ppm（CarrPurcellMeiboomGill，CPMG）or６．００ppm（longitudinaleddydelay，LED）asdefaulted１

HspectravaluesbyusingtheVNMRsoftware．Dataweresavedastextorexcelfilesafternormalizationandthenusedforpatternrecognitionanalyses．Allthedatawereanalyzedbyprincipalcomponentanalysis（PCA）usingtheSIMCAP１０．０software（UmetricsAB，Umea，Sweden）．

基金项目：国家自然科学基金资助项目（No．３０６７２５７８）

Correspondence：JiaxuCHEN，MD，Professor；Tel：０１０６４２８７０７４；Email：chenjiaxu＠hotmail

．com

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Results：ThePCAanalysisofratplasmaHNMRspectrarevealeddifferentmetabolicspectrabetweenstress

andcontrolgroups，whichwereconsistentwithalterationsofinvivometabolismsinratsunderstressstimuli．Comparedwiththenormalcontrolgroup，ratswithrepeatedstressdisplayedsignificantchangesinspectralpeakshapesofacetate，lactate，tyrosine，lowdensitylipoprotein，andunknowncompounds（３．４４ppm）．Thesealteredmetabolitescanbeusedasbiomarkersofsyndromeofliverqistagnationandspleendeficiencyforfurtherstudies．

１

Conclusion：TheHNMRspectraofmetabolitesintheratbloodaredifferentiallychangedafterchronicstress．Specific，characteristicmetabolicproductscanbeidentifiedbyanalysesofmetabonomics，whichleadtointerpretationofbiologicalfeatureofChinesemedicinesyndromes．Therefore，metabonomicanalysisisanapproachwithgooddevelopmentprospectstostudiesofTCMsyndromes．

Keywords：metabonomics；patternrecognition；nuclearmagneticresonance；traditionalChinesemedicine；rats

LuoHG，DingJ，YueGX，ChenJX．JChinIntegrMed／ZhongXiYiJieHeXueBao．２００７；５（３）：３０７３１３．ReceivedDecember６，２００６；publishedonlineMay１５，２００７．Freefulltext（PDF）isavailableatwww．jcimjournal．com

　　代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。它主要研究生物对外源性物质所引起的病理生理反应，以及对遗传变异的应答和内源性代谢物的动态变化，通过对生物体液和组织中随时间改变的代谢物进行检测、确定、定量和分类，将这些代谢信息与病理生理过程中的生物学事件关联起来，以监测活细胞中的化学变化。

本课题组用慢性束缚应激大鼠模型，以动物行为学评定和以方测证等方法确定该模型为肝郁脾虚证候模型，运用代谢组学技术开展中医证候学的研究，试图通过对中医病证引起的代谢物的共性分析和生物标记物的发现，寻找中医证候的生物学本质，促进中医辨证的科学化和定量化，将代谢组学技术和中医药学的研究结合起来，探索出中医药复杂理论体系研究的新方法与新途径。1　材料与方法

１．１　动物与分组　实验用二级雄性SD大鼠２４只，体质量（２００±２０）g，购自北京维通利华实验动物研究中心，合格证号为SCXK京２００２０００３。适应性饲养３d后随机分为：７d正常对照组（A组）、２１d正常对照组（B组）、７d模型组（C组）和２１d模型组（D组）４组，每组各６只。动物每笼６只群养，饲养于普通级动物房，室内温度保持为（２２±２）℃，相对湿度保持为３０％～４０％，各组大鼠喂常规饲料，自由进食饮水。

１．２　造模方法　以慢性束缚方法制作大鼠肝郁脾虚证模型，将大鼠束缚于特制的束缚架上（T型束缚台：底座宽１０cm、长２０cm、厚２．８cm，上端束缚台长２２cm，最宽处６．６cm，前端有固定头部的小架和适合四肢放置的凹槽，上端束缚台有３条可调的软

带，两宽一窄，分别在头颈部、胸腰和腰背固定），３h／d，C组连续７d，D组连续２１d，随机选取束缚时间点。整个束缚过程中动物在同一环境中，不予以进水和食物。正常对照组均散养于各自的饲养箱中３h。

１．３　取材与处理

［１，２］

　分别于第８天和第２２天清

晨８时，用２％戊巴比妥钠４０mg／kg腹腔注射进行深度麻醉，手术剪剖开胸腔，用注射器穿刺左心室取血浆，采集血浆后于－２０℃冰箱中保存备用。

核磁共振（nuclearmagneticresonance，NMR）测量前样品准备：取出血浆，常温解冻，用德国Ep１０min），取上清３００μl，添加０．１％２，２，３，３，三甲基甲硅烷基丙酸｛３（trimethylsiyl）［２，２，３，３H４］

２

pendorf公司产５４２４型离心机离心（１４０００r／min，

５mm样品管中，混匀，于４℃冰箱保存，备用。

propionate，TSP｝重水溶液１００μl、２００μlD２O于

１．４　NMR数据采集　在军事医学科学院生物医学分析中心核磁共振实验室进行检测，２７℃条件下，在VarianUnityInova６００M超导傅立叶变化核磁共振波谱仪上调用弛豫时间编辑（CarrPurcelleddydelay，LED）相关脉冲序列，采用预饱和方式MeiboomGill，CPMG）和扩散编辑（longitudinal

抑制水峰，饱和时间为２s，混合时间为０．１５s，谱宽８０００Hz，采样点数３２k，累加次数６４次，预饱和频

率和中心频率都在水峰位置。自由感应衰减（freeinductiondecay，FID）信号经过３２k傅立叶变换转为一维NMR谱图。以TSP为化学位移参考峰的位置，设为０ppm。调用VNMR软件中的程序将

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６．０～０ppm（LED），每段为０．０４ppm，进行分段积分。将积分数据归一化之后，以文本文件或Excel文件贮存，用于模式识别分析。

H谱按默认值，分别从４．５～０．５ppm（CPMG）以及

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１．５　主成分分析　将积分值进行中心化和比例换算Umea，用）SIM进C行A主P成１０分．０软件包分析（（瑞典principal，Umetcoricsmponent

AB，analynentssis，P，CPC），利A）用，求PC出对主各成组大分鼠（principal清的代compo谢组分

进行分析，必要时进行判别分血析（partialleastsquaresdiscriminateanalysis，PLSDS）。2　结　果

２．１　四组动物血清１

HNMR图谱　见图１。

图1　四组动物血清的典型1HNMR谱图

Figure1　Serumspectraof600MHz1HNMRin4groups

A：GroupcontA（７roldgronormD：upGroup）al；controClgroup）；B：GroupB（２１dnormal

D：Gro（２１updCstress（７dgrostressup）．

group）；

２．２　时点相同的正常对照组与模型组动物血清１

NMR谱模式识别分析　A、C两组动物血清LED

实验１

LED实验表明HNMR谱的波峰积分值的：A、C两组大致以tP５CA轴分结果见图开，A组２样

。本中极低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein，LDVLDLL）（）０和．８７低、密０．９１度脂、０蛋．９５白（和low０．９９）density、高密lipopro度脂蛋tein白，

（highdensitylipoprotein，HDL）（０．８３）、胆碱

（３．２３和３．２７）、N乙酰糖蛋白（Nacetylglycoprotein长链脂肪，NAC酸）（１NA．３１C１（２、１．２３．０７）、１等．２７化、１合．３６物和含量１．较３９）高、NAC；C组

２（２．１５）以及１．５９ppm处未知化合物含量较高。峰积分值的B、D两组动物血清PCA结果见L图ED３实验１

。B、DH两N组M样本R谱的间波

沿t中４轴方向基本LDL（０．８７、分开０．９１。和从因１．２７）子载以及荷图上化学看位移，B在组样４～本５左右的含氧脂肪酸、不饱和脂肪酸等化合物的含量较高；D组样本中LDL含量不高，NAC１（２．０７）、

酸含量较高NAC２（２．１６）。

及化学位移在１～３之间的饱和脂肪

波峰积分值的A、C两组动物血清PLSDA结果见图CPMG实４验１。CHPMNGMR实验结谱的

果表明，A组和C组组内样本间个体差异较大，且点c５与其他点有明显差异。在排除点c５的基础上

进行PLSDS。从得分图中可以看出，A、C两组可被图中所示虚线大致分开。从因子载荷图中可以看出，A组样本中乳酸（１．３６、１．３８、１．４、４．１６和４．１２）、丙氨酸（１．４４）、脂类化合物（０．９２和１．３６）、血糖（３～４）、NAC２（２．１６）以及谷氨酸（２．４）含量较高；而C组样本中NAC１（２．０８）、小分子化合物（１．１２）以及乙醇和１．２ppm与３．４ppm所代表的未知化合物含量较高。两组都未能分开B和D组进行的。

CPMG实验，PLSDS和PCA

２．３　不同时点的正常对照组组间和模型组组间的动物血清１

物血清LEDH实验NMR１H谱模NM式R识谱的波峰积分值的别分析　A、B两组PC动结果见图５。LED实验表明：A、B两组被图中所示A

虚线较好地分开。因子载荷图结合原始图谱分析，和A组样本中１．３５）、胆V碱LDL（３．２３和LDL、３．２７）（０．以８７及、０不．９１饱、１和．２７脂、肪１．酸３１（１．９９、５．３１和５．３５）等化合物含量较高；B组仅化学位移在３～４之间的可能为含氧脂肪酸的化合物含量较高。

峰积分值的C、D两组动物血清PCA结果见LE图D６实验１。C、DH两N组M分组R谱的趋波势明显，但是点c６与本组其他样本间有明显不同。排除c６后仍进行PCA分析，得分图中可看出，C、D两组沿t１轴能较好地分开，因而t１轴方向表示组间差异；各组内样本沿t２轴方向散开，因而t２轴方向表示组内差异。因子载荷图结合原始谱图分析，C组样本中VLDL和LDL（０．８７、０．９１、１．２７、１．３１和１．３５）、胆碱（３．２３、３．２７）以及不饱和脂肪酸（５．３１、５．３５）等化合物含量较高；而D组中仅化学位移在３～４之间的可能为含氧脂肪酸的化合物和NAC含量较高。

A、B两组动物血清CPMG实验１

波峰积分值的PCA结果见图７。CPMHGN实M验表明R谱的

，，子载荷图中可以看出A、B两组样本可被如，图所A组样本中乳酸示虚线大致分（１．开３６）。、苏氨从因

酸（１．３２）、脂类化合物（０．９２、０．９６）、丙氨酸（１．５２）、小分子化合NAC１（２．０８）物、含３羟基丁酯量较高；而（１B．２８）组以及样本中２～血３糖之间（３的～４）、谷氨酸（２．４４）、醋酸（１．９６）及１．４８ppm和

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１．２４ppm处所表示的未知化合物含量较高。波峰积分值的PCA结果见图８。C、D两组样本沿t２轴显示出一定的分组趋势，但两组内样本间差异太大，而且c５和d１两样本与其他样本间有明显不同。排除c５和d１后对剩余数据进行PCA分析，从得分图中可看出，两组样本被图中所示虚线分开。从因子载荷图中可看出，C组样本中脂类化合物（０．９６、０．８９、０．９２、１．３２和１．３６）、血糖（３～４）、３．４ppm处所表示的化合物含量较高；D组样本中NAC１（２．０８）、NAC２（２．２），以及１．２４ppm和

C、D两组动物血清CPMG实验HNMR谱的

１

乳酸（１．４、４．１６）、醋酸（１．９６）、胆碱（３．２４）、１．４８ppm等处化合物含量较高。

２．４　对１HNMR图谱及模式识别的进一步分析　

各正常对照组图中主成分积分值基本集中分布于椭圆形散点图（９５％置信区内）的４个区域，各正常对照组间无明显交叉和重叠。对其进一步分析发现，

与正常对照组相比，C、D两组中醋酸（１．９９、４．１２、４．１６）及３．４４ppm的未知化合物的谱峰相对积分面积明显增高而乳酸（１．３４）、酪氨酸（６．９５、７．２７）和明显下降。见图１、２、３和

４。

LDL（０．８７、０．９、０．９５和０．９９）的谱峰相对积分面积

图2　A、C两组血清代谢组PCA分值（t［4］vst［5］）散点分布和因子载荷（p［4］vsp［5］）图（扩散编辑）Figure2　PCAscore（t［4］vst［5］）andloading（p［4］vsp［5］）plotsforgroupsAandCserumspectra（LED）

A：GroupA（７dnormalcontrolgroup）；C：GroupC（７dstressgroup）．

图3　B、D两组血清代谢组PCA分值（t［3］vst［4］）散点分布和因子载荷（p［3］vsp［4］）图（扩散编辑）Figure3　PCAscore（t［3］vst［4］）andloading（p［3］vsp［4］）plotsforgroupsBandDserumspectra（LED）

B：GroupB（２１dnormalcontrolgroup）；D：GroupD（２１dstressgroup）．

图4　A、C两组血清代谢组PLSDS分值（t［1］vst［2］）散点分布和因子载荷（wc［1］vswc［2］）图（弛豫编辑）Figure4　PCAscore（t［1］vst［2］）andloading（wc［1］vswc［2］）plotsforgroupsAandCserumspectra（CPMG）

A：GroupA（７dnormalcontrolgroup）；C：GroupC（７dstressgroup）．

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图5　A、B两组血清代谢组PCA分值（t［1］vst［2］）散点分布和因子载荷（p［1］vsp［2］）图（扩散编辑）Figure5　PCAscore（t［1］vst［2］）andloading（p［1］vsp［2］）plotsforgroupsAandBserumspectra（LED）

A：GroupA（７dnormalcontrolgroup）；B：GroupB（２１dnormalcontrolgroup）．

图6　C、D两组血清代谢组PCA分值（t［1］vst［2］）散点分布和因子载荷（p［1］vsp［2］）图（扩散编辑）Figure6　PCAscore（t［1］vst［2］）andloading（p［1］vsp［2］）plotsforgroupsCandDserumspectra（LED）

C：GroupC（７dstressgroup）；D：GroupD（２１dstressgroup）．

图7　A、B两组血清代谢组PCA分值（t［2］vst［3］）散点分布和因子载荷（p［2］vsp［3］）图（弛豫编辑）Figure7　PCAscore（t［2］vst［3］）andloading（p［2］vsp［3］）plotsforgroupsAandBserumspectra（CPMG）

A：GroupA（７dnormalcontrolgroup）；B：GroupB（２１dnormalcontrolgroup）．

图8　C、D两组血清代谢组PCA分值（t［1］vst［2］）散点分布和因子载荷（p［1］vsp［2］）图（弛豫编辑）Figure8　PCAscore（t［1］vst［2］）andloading（p［1］vsp［2］）plotsforgroupsCandDserumspectra（CPMG）

C：GroupC（７dstressgroup）；D：GroupD（２１dstressgroup）．

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