人参皂苷ck制备_人参皂苷的合成基因_人参皂苷生物合成研究进展

发布时间：2016-06-09 17:07

  本文关键词：人参皂苷生物合成研究进展，由笔耕文化传播整理发布。

人参皂苷生物合成研究进展

首页 > 广润快报

声明：本文章摘自期刊，非本公司自行发表，仅供学习参考，，不做其他用途。

人参皂苷生物合成研究进展

杨金玲, 高丽丽, 朱 平*

(中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室 &

卫生部天然药物生物合成重点实验室, 北京 100050)

摘要: 人参皂苷是名贵药材人参和西洋参等人参属植物的主要有效成分, 具有较好的抗肿瘤、抗炎、抗氧化
和抑制细胞凋亡等药理活性。但人参皂苷在人参和西洋参中含量很低, 大大限制了其开发与应用, 利用生物技术
手段合成人参皂苷并提高其含量已成为研究热点。近年来通过组织培养和生物转化进行人参皂苷生物合成的研
究取得了一些进展。在人参皂苷生物合成途径解析及其反应机制研究方面, 目前已从人参属植物中克隆到 20 多
个与人参皂苷生物合成相关的基因并进行了功能验证, 为通过合成生物学技术生产人参皂苷提供了基本的元器
件。本文就以上几个方面的研究进展进行综述, 为人参皂苷生物合成途径及其调控的深入研究提供理论依据。
关键词: 人参皂苷; 合成生物学; 组织培养; 生物转化

中图分类号: R931 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2013) 02-0170-0

Advances in the biosynthesis research of ginsenosides
YANG Jin-ling, GAO Li-li, ZHU Ping*
(State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines & Key Laboratory of Biosynthesis of
Natural Products, Ministry of Health of PRC, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences &
Peking Union Medical College, Beijing 100050, China)
Abstract: Ginsenosides are the main active components of medicinal herbs including Panax ginseng and
Panax quinquefolium, which have potent effects of anti-tumor, anti-inflammatory, antioxidant and apoptosis
inhibition. But the low content of ginsenosides limits its development and usage. At present, how to improve
the production of ginsenosides by biological technology has been a new research focus. Some advances in the
biosynthesis of ginsenosides by tissue culture and biotransformation have been made in recent years. So far at
least twenty genes related to the biosynthesis of ginsenosides from Panax genus plants have been cloned and
functionally identified, which has laid a good foundation for the study on the synthetic biology of ginsenosides.
This review outlines recent advances in several aspects and is expected to provide a theoretical support to the
thorough research of the pathway and regulation of ginsenosides biosynthesis.
Key words: ginsenoside; synthetic biology; tissue culture; biotransformation

人参皂苷是名贵药材人参和西洋参等人参属植物的主要有效成分。现代药理学研究表明, 人参皂苷具有较好的抗肿瘤、抗炎、抗氧化和抑制细胞凋亡等药理活性[1]。人参皂苷属于三萜类, 是由苷元和糖相连而成的糖苷类化合物。根据苷元不同, 人参皂苷可
分为 3 种类型: 一类是齐墩果烷型五环三萜类皂苷Ro, 其皂苷元为齐墩果酸; 另两类是人参二醇型皂苷 (如 Rb1、Rb2、Rc、Rd、F2、Rg3、Rh2 等) 和人参三醇型皂苷 (如 Re、Rg1、Rg2、Rf、Rh1 等), 两者均属于达玛烷型四环三萜类皂苷, 它们在人参皂苷中占大多数, 是其中的主要活性成分。迄今为止,已经分离并确定结构的人参皂苷约有 60 余种。多数皂苷单体具有显著药理作用, 新药开发前景较好,如 Rg1、Rb1 具有抗衰老活性, Rg3、Rh2 具有抗肿瘤活性等[2]。
人参皂苷在人参和西洋参中含量较低, 有限的天然资源难以满足日益增长的医药及研发需求, 而且长期依靠采集野生资源作为药源, 必然导致天然资源的枯竭, 严重破坏生态平衡。而人工种植人参、西洋参需要 4～15年的生长栽培周期, 又面临农药残留、重金属污染及品种退化等问题, 这些都是大规模推广种植的制约因素。为了摆脱药源匮乏的困境, 同时保护珍贵的天然资源, 近年来国内外学者通过组织培养、生物转化及合成生物学等途径对人参皂苷的生物合成进行了探索, 取得了一些成果。本文就这些进展进行了综述, 并展望了人参皂苷生物合成的发展前景。
1 利用组织培养解决人参资源紧缺的研究
从 20 世纪中期开始, 许多研究者就开始致力于人参和西洋参的组织培养研究, 试图通过组织和细胞培养解决这些贵重药材的资源供应问题, 或通过试管苗的获得使其快速繁殖成为可能。关于人参和西洋参的组织培养研究, 近年来已有多篇综述文章报道[3, 4]。植物组织与细胞培养要达到工业化生产,最终必须建立起大规模培养的方法——反应器培养。日本已经在 20 000 L 生物反应器上成功地进行了每月100 kg的人参细胞培养, 用于生产食品添加剂, 培养物中人参皂苷的含量组成与栽培的人参根几乎完全一致[5]。韩国也已经在人参不定根和毛状根的发酵培养方面取得了较大进展, 反应器的规模已达到10 000 L[6]。我国已经通过人参愈伤组织培养开发出丁家宜系列化妆品等[7]。
尽管人参和西洋参的组织与细胞培养研究已经比较深入, 在细胞培养、毛状根和冠瘿瘤培养以及反应器培养等方面都取得了一些进展, 但仍存在一些问题, 如细胞株不稳定、放大培养困难、目的产物含量低及培养条件复杂导致成本高等, 因此需要寻求更合适的培养条件和易于工业化生产的技术方式,以满足人们对人参和西洋参药材以及人参皂苷类成分的医药及研发需求。
2 通过生物转化获得稀有人参皂苷和苷元的研究
各种人参皂苷在人参属植物中含量不同, 并且具有不同的药理功能。有些人参皂苷含量较高, 如Rb1 和 Rg1, 而另外一些人参皂苷含量甚微, 为稀有人参皂苷, 如 Rh1、Rh2、Rh3 和 Rg3 等[2]。许多药理研究表明, 稀有人参皂苷通常具有更好的药理活性。人参皂苷苷元的抗肿瘤活性最强, 随着糖基数目的增加, 人参皂苷抗肿瘤活性依次减弱, 即: 苷元 >单糖苷 > 二糖苷 > 三糖苷 > 四糖苷[8]。通过研究人参皂苷在体内的代谢规律, 也发现绝大多数人参皂苷在胃肠道中吸收较差, 脱去糖基的次级苷和苷元比皂苷具有更强的药理活性和更高的生物利用度[9−11]。稀有人参皂苷和苷元在人参原植物、细胞培养物、不定根及毛状根中含量甚微, 以前主要通过物理法和化学法水解皂苷糖苷键获得, 但水解条件剧烈, 不易控制, 反应副产物多, 而且排放大量有机溶剂、酸和碱等污染物, 对环境造成很大危害。为了避免破坏生态环境, 且得到可持续利用的资源, 许多研究者通过生物转化途径改变人参皂苷的糖链结构, 以获得稀有人参皂苷和苷元[12]。生物转化就是利用有机体 (细胞、细胞器) 或酶作为催化剂实现化学转化的过程, 是生物体系 (包括细菌、真菌和植物组织等) 对外源性底物进行结构修饰的化学反应。其本质是利用生物本身所产生的酶对外源底物进行的催化反应。生物转化具有选择性强、反应条件温和、副产物少、后处理简单及对环境友好等优点。近年来, 以人参皂苷为原料进行生物转化的研究越来越多, 获得了许多有意义的成果。人参皂苷的生物转化主要是利用微生物或酶对人参二醇型皂苷的 C3 和 C20 位、三醇型皂苷的 C6 和 C20 位的糖基结构进行修饰, 使含量较高的人参皂苷的糖基经过水解作用, 定向转化为稀有皂苷和苷元[13]。生物转化的方法主要有微生物转化法和酶转化法。
2.1 微生物转化 

微生物转化法成本低、副产物少、应用广泛。许多研究者模拟人参皂苷的体内代谢, 通过一些肠内菌群对人参皂苷进行转化, 发现人参皂苷发挥作用的真正有效成分是苷元, 这为开发新药奠定了基础[14]。Bae 等[15]从肠道菌群中分离出可以将人参皂苷转化成 Compound K 的乳酸菌, 还通过肠道菌 Bacteroides sp.、Eubacterium sp.、Bifidobacterium sp.将 Rg3 转化为 Rh2 和 PPD[16]。对人参皂苷进行生物转化的微生物除了肠道菌以外, 还有曲霉属、青霉属、根霉属及毛霉属等霉菌[17]。Dong 等[18]发现小型丝状真菌黑曲霉 (Aspergillus niger 3.1858) 和蓝色犁头霉 (Absidia coerulea 3.3538) 具有将 Rg1 转化为 Rh1 的能力, 转化率为 80.9%。付建国[19]应用大型药食两用菌与西洋参及其根部提取物进行共培养, 并以固态发酵法对人参皂苷进行生物转化, 结果发现菌体生长所分泌的酶系对二醇型皂苷有分解的功能, 对三醇型皂苷的分解功能极弱, 可以产生Compound K。Cheng 等[20]通过能产生 β-葡萄糖苷酶的 Caulobacter leidyia 将人参皂苷 Rb1 转化为 F2。包海鹰等[21]利用黑根霉 (Rhizopus sp.) 将人参皂苷Re 转化为 Rg1、Rg5 和 Rk1, 转化率可达 92.16%。崔宇等[22]从种植人参的土壤中分离了 4 个菌株, 通过对人参果总皂苷 (SFPG) 进行转化, 筛选出一株能转化得到 Compound K 的镰刀霉属霉菌 (Fusariumspp.), 该 菌 株 转 化 专 一 性 强 , 转 化 效 率 高 , 为Compound K 的工业化生产提供了一条新途径。戴均贵等[23, 24]在人参皂苷生物转化方面也做过大量的工作, 通过尖孢镰孢霉 (F. oxysporum) Z-001 将 Rg1 和Rb1 进行转化, 共得到 9 个代谢产物, 其6α,12β-dihydroxydammar-3-one-20(S)-O-β-D-glucopyranoside和 3a-oxa-3a-homo-6α, 12β-dihydroxydammar-3-one-20(S)-O-β-D-glucopyranoside 为新化合物; 通过蓝色犁头霉 AS3.2462 将 Rg1 转化为 5 个代谢产物, 其中3-oxo-7β-hydroxy-20(S)-protopanaxatriol 和 3-oxo-7β,15α-dihydroxy-20(S)-protopanaxatriol 为新化合物。
2.2 酶转化 

相对于微生物转化而言, 酶转化法反应周期短, 污染小, 所得的产物纯度高, 可控性强,而且具有一定的专属性, 不同性质的酶作用于不同构型、不同组成的糖苷键, 从而可以定向形成目的产物。Ko 等[25]对各种糖苷水解酶水解三醇型皂苷混合物进行了研究。利用来源于米曲霉 (Aspergillusoryzae) 的半乳糖苷酶和青霉菌 (Penicillium sp.)的乳糖酶粗酶液水解三醇型皂苷混合物, 分别产生了大量的 Rg2 和 Rh1; 利用来源于斜卧青霉 (P.decumbens) 的柚皮苷酶粗酶液水解三醇型皂苷混合物, 产生了肠道菌代谢产物 F1 和少量的 20(S)-PPT。这是首次利用酶解法转化三醇型皂苷混合物高效制备 Rg2、Rh1 和 F1 的报道。后来又对各种糖苷水解酶转化二醇型皂苷混合物进行了研究, 发现来源于米曲霉的乳糖酶、β-半乳糖苷酶和来源于绿色木霉(Trichoderma viride) 的纤维素酶粗酶液可分别转化产生 F2、Compound K 和 Rd; 来源于青霉菌的乳糖酶粗酶液可转化产生 Rd、Rg3 和 Compound K。这是利用二醇型皂苷混合物酶法大量制备 F2 和 Rg3 的首次报道[26]。Liu 等[27]利用从黑曲霉中得到的粗糖苷酶转化Rg3(R)为 PPD(S, R), 转化率高达 100%; 转化Rf为20(S)-PPT, 转化率为90.4%[28]。金凤燮研究组[29]围绕酶转化法生产稀有皂苷 Rh2 开展了大量的工作。利用新发现的人参皂苷 β-葡萄糖苷酶, 部分水解人参二醇型皂苷糖基, 经过转化生产 Rh2 等皂苷。他们筛选育种了产酶工程菌, 开发出酶转化产物次生皂苷的分离纯化技术, 通过酶转化法可以产业化生产Rh2。这种方法经生产实践表明, 从人参二醇型皂苷生产 Rh2 的转化率为 60%以上, Rh2 纯度达 90%, Rh2的收率为人参原料的 0.5%以上, 比从红参中提取的产率提高 500 倍。反应后酶的回收率是 60%。

随着基因工程技术的发展, 近年来一些研究者开始尝试将糖苷酶基因转入大肠杆菌, 通过高表达得到的重组酶对人参皂苷进行生物转化, 已取得了一些进展。Noh 等[30]将从 Sulfolobus solfataricus 中克隆到的 β-糖苷酶基因转入大肠杆菌, 得到的重组酶能将人参根提取物转化为 Compound K, 转化率为80.5%。Yoo 等[31]将从火球菌属的 Pyrococcus furiosus中克隆的 β-糖苷酶基因转入大肠杆菌, 得到的重组酶将人参根提取物首先转化成 Compound K, 转化率为 79.5%, 然后转化成苷元 PPD, 转化率为 100%,苷元的产量可达 1.8 g·L−1。该研究在已报道的文献中,Compound K 和苷元的产率是最高的, 因此具有较好的产业化前景。

人参皂苷的生物转化虽已取得了较大的进展,但为了实现其产业化, 必须筛选到可以专一性转化的高产菌株及酶, 或通过基因工程得到具有高转化活性的重组酶, 再建立合适的工业生产条件, 这对于大规模生产人参皂苷类衍生物及其创新药物研究具有重大意义。
3 人参皂苷合成生物学研究探索
天然药物合成生物学是在基因组学研究的基础上, 对天然药物生物合成相关元器件进行发掘和表征, 借助工程学原理对其进行设计和标准化, 通过在底盘细胞中装配与集成, 重建生物合成途径和代谢网络, 从而实现药用活性成分定向、高效的异源合成, 以解决天然药物研发和生产制造的一系列重大问题[32]。在天然药物设计合成领域, 合成生物学的应用使人们能够更为精确地控制代谢途径, 利用对天然产物生物合成途径的遗传操作来生产基于天然产物的创新药物分子, 也可以设计和构建一些能够生产重要天然药物的人工合成的“超级产生菌”, 只需对“超级产生菌”进行发酵就可以直接获得所需的目的化合物, 有望成为未来最有前途的药物生产的绿色环保技术之一, 可以有效解决植物来源的天然药物研发可能引起的资源问题。目前合成生物学已在一些药用天然产物的制造中获得了较大的进展。王伟等[33]首次从中国红豆杉中克隆到紫杉烯合酶基因, 将其导入酿酒酵母组建了一条紫杉烯生物合成途径, 重组菌可以直接产生紫杉醇的前体—紫杉烯,为紫杉醇类化合物的合成生物学研究奠定了基础。Ajikumar 等[34]利用大肠杆菌实现了紫杉醇关键前体紫杉烯的发酵生产, 通过分批补料培养 (fed-batchcultivation) 产量可达 1 g·L−1, 这意味着将来有望通过进一步优化紫杉醇生物合成的其他步骤, 最终实现通过合成生物学途径大量制备紫杉醇。孔建强等[35]通过将青蒿素生物合成相关基因转入酿酒酵母, 得到了青蒿素前体紫穗槐-4, 11-二烯和青蒿酸, 而且将紫穗槐-4, 11-二烯合酶进行全基因优化, 使紫穗槐-4,11-二烯合酶催化效率显著提高, 进而大大提高了工程菌中紫穗槐-4, 11-二烯的产率。Westfall 等[36]构建了生产紫穗槐-4, 11-二烯的酿酒酵母工程菌, 通过分批补料培养产量可达 40 g·L−1, 并将其半合成为青蒿素的直接前体二氢青蒿酸, 总得率为 48.4%, 这使得通过合成生物学途径大量制备青蒿素前体成为可能,将会简化青蒿素的合成路线, 从而大幅降低青蒿素
的生产成本。
近年来, 关于人参皂苷生物合成途径及其反应机制的研究已取得了一些进展, 为通过合成生物学技术生产人参皂苷奠定了基础[37, 38]。人参皂苷生物合成途径包括 20 余步连续的酶促反应 (图 1)。其中的关键酶有 3-羟基-3-甲基戊二酰 CoA 还原酶 (3-
hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, HMGR)、法呢基焦磷酸合酶 (farnesyl diophosphate synthase,FPS)、鲨烯合酶 (squalene synthase, SS)、鲨烯环氧酶 (squalene epoxidase, SE)、达玛烯二醇-II 合酶(darmmarenediol-II synthase, DS)、β-香 树素 合酶(β-amyrin synthase, AS)、细胞色素 P450 (cytochromeP450, CYP450) 和糖基转移酶 (glycosyltransferase,
GT) 等。

3.1 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶 (HMGR)
HMGR 被公认为人参皂苷生物合成途径中的第一个限速酶, 是萜类合成过程中最先起作用的关键酶, 通过影响人参皂苷前体 IPP 和DMAPP 的产量而影响人参皂苷的生物合成。Wu 等[39]从 4 年生西洋参根中克隆到 HMGR 基因, 其编码的蛋白由 589 个氨基酸组成, 生物信息学分析表明 HMGR 含有两个跨膜结构域和一个催化结构域。该基因与从许多植物中克隆到的 HMGR 基因具有较高的同源性, 尤其是与喜树的HMGR基因的同源性高达83.8%, 而喜树中的单萜类吲哚生物碱——喜树碱的生物合成须通过甲羟戊酸 (mevalonate, MVA) 途径, 由此推断 HMGR 基因与人参皂苷的生物合成密切相关。

3.2 法呢基焦磷酸合酶 (FPS)

Kim 等[40]从人参根中克隆到编码 FPS 的基因 PgFPS, 其编码的氨基酸序列与拟南芥、橡胶、黄花蒿和积雪草的 FPS 分别有 77%、84%、87% 和 95% 的同源性。Southern blot分析表明, 人参中有两个以上的基因编码 FPS。通过大肠杆菌表达 PgFPS 确证了重组蛋白具有 FPS 的活性。用茉莉酸甲酯处理人参的毛状根能够同时提高 PgFPS 的 mRNA 水平和 FPS 的活性。之前有过茉莉酸甲酯诱导人参根悬浮细胞中人参皂苷积累的报道[41], 极有可能与 PgFPS 的表达水平提高有关。Kim等[42]还将人参的 PgFPS 转到积雪草毛状根中使其过量表达, 发现积雪草达玛烷合酶的 mRNA 水平显著提高, 三萜皂苷羟基积雪草苷和积雪草苷的产量瞬时升高。上述研究表明, FPS 在三萜类化合物的生物合成中起着重要作用, 是运用合成生物学技术提高人参皂苷产量的一个重要元器件。

3.3 鲨烯合酶 (SS) 

SS 处于类异戊二烯途径的一

个分支点, 催化甾醇和三萜类化合物合成的起始步骤, 其含量和活性对人参皂苷的产量起着非常重要的作用。Lee 等[43]从以人参叶为材料构建的 cDNA 文库中克隆到 SS 基因 PgSS1, 该基因与大豆、拟南芥、烟草和水稻中的 SS 基因分别具有 84.1%、75.78%、81.45% 和 71.33% 的同源性。构建了 SS 基因的植物表达载体, 通过转化人参得到不定根来上调该基因的表达, 结果表明所有的下游基因表达都得到了上调, 从而导致甾醇和人参皂苷的增加, 表明 SS 对甾醇和人参皂苷的生物合成均起着调控作用。Kim 等[44]从以不定根为材料构建的表达序列标签 (EST) 文库中克隆到另外两个 PgSS1同源基因: PgSS2和 PgSS3。功能互补分析表明, PgSS1、PgSS2 和 PgSS3 都能使酿酒酵母 SS 基因缺陷型突变体回复为麦角甾醇原养型。原位杂交分析表明, 这 3 个基因在人参不同器官中的转录水平不同。这些结果表明这 3 个 SS 基因表达模式不同但都参与人参的鲨烯合成。Seo 等[45]通过根癌农杆菌介导将人参的 SS 基因转入刺五加愈伤组织, 使其表达代谢终产物。结果表明, 增强人参 SS的活性会使甾醇的产量显著增加, 同时也能提高三萜皂苷的产量。因此推断 SS 是人参皂苷合成的一个关键酶, 提高 SS 表达量不仅促进 FPP 向鲨烯的转化,同时还能上调下游其他酶的活性, 进而提高甾醇和三萜类化合物的产量。蒋世翠等[46]根据人参 SS 基因设计正义及反义片段引物, 构建了 SS 基因干扰表达载体, 通过农杆菌介导转化人参愈伤组织, 转化后的愈伤组织 SS 基因表达量降低, 皂苷含量也有所变化,由此推断 SS 是人参皂苷生物合成途径的关键酶, 抑制 SS 基因的表达可调控人参皂苷的产量。因此, SS也是利用合成生物学技术提高人参皂苷产量的一个
非常重要的元器件。

3.4 鲨烯环氧酶 (SE) 

SE 催化甾醇和三萜类生物合成的第一步氧化反应, 被认为是其合成的限速酶之一。Han 等[47]分别从以人参叶片和不定根为材料构建的 cDNA文库中克隆到 PgSQE1 和 PgSQE2 两个SE 基因, 通过 PgSQE1 的 RNA 干扰 (RNAi) 技术发现, 在转基因人参根中 PgSQE1 的沉默可以明显上调 PgSQE2 和环阿屯醇合酶 (cycloartenol synthase,CAS) 的表达, 从而导致甾醇含量的提高。此结果表明 PgSQE1 和 PgSQE2 具有不同的调控机制, PgSQE1只参与人参皂苷的合成, 而与甾醇的产生无关。蒋世翠等[48]探讨了西洋参不同组织器官中总皂苷和单体皂苷量的差异及其与 SS 和 SE 基因表达量之间的关系, 发现 SS 和 SE 基因在 14 个组织器官中的表达量具有非常显著的差异, 并与人参皂苷 Re、Rg1、Rb1、Rd 和总皂苷量之间存在显著的正相关关系。由此可见, SS 和 SE 在人参皂苷合成途径中都起着极其重要的作用。

3.5 达玛烯二醇-II合酶 (DS) 和β-香树素合酶 (AS)
由氧化鲨烯环化酶 (oxidosqualene cyclase, OSC) 催化的 2, 3-氧化鲨烯环化是三萜皂苷和甾醇生物合成分支形成的关键位点。OSC 构成多基因家族, 由氧化鲨烯环化可产生 100 多种不同骨架的三萜类化合物。目前已经从各种不同植物中克隆到 OSC 基因。从人参中克隆到与人参皂苷合成相关的 OSC 基因有两个,即 DS 和 AS 基因, 分别是合成达玛烷型和齐墩果烷型人参皂苷的关键酶基因。Kushiro 等[49]以人参毛状根为材料制备微粒体, 发现其在体外能将 2, 3-氧化鲨烯环化为达玛烯二醇-II。Tansakul 等[50]根据 OSC基因保守序列设计简并引物, 从人参毛状根中克隆到 DS 基因 PNA, 该基因转入酿酒酵母后能催化产生达玛烯二醇-II。Han 等[51]从以人参花为材料构建的EST 文库中克隆到一个 DS 基因 DDS, 与上述 PNA基因序列一致。研究发现转入 DDS 基因的酿酒酵母能产生达玛烯二醇-II 和羟基达玛烯酮; 茉莉酸甲酯能上调 DDS 基因的表达; 通过 RNAi 技术使 DDS
基因沉默能使人参根中的皂苷产量降低到原来的84.5%。Lee 等[52]将 DDS 基因转入烟草中, 使烟草产生了达玛烯二醇-II, 从而使烟草对烟草花叶病毒的抵抗力明显提高。这些结果表明 DS 在人参皂苷的生物合成途径中起着非常重要的作用, 是采用合成生物学技术获得达玛烷型人参皂苷的一个重要元器件。AS 催化 2, 3-氧化鲨烯环化合成 β-香树素, 是目前为止发现的齐墩果烷型人参皂苷 Ro 合成的唯一关键酶。Kushiro 等[53]从人参毛状根中克隆到了 AS的 cDNA 序列 PNY, 将 PNY 转入酿酒酵母可催化产生 β-香树素。赵寿经等[54]也从人参毛状根中克隆到了AS基因, 并成功构建了AS基因的反义植物表达载体, 试图通过建立 AS 基因的反义表达载体, 利用反义 RNA 技术抑制 AS 基因的表达, 使代谢流主要流向达玛烷型三萜皂苷支路, 从而达到提高人参皂苷含量的目的。

3.6 细胞色素P450 (CYP450)

CYP450对人参皂苷

三萜碳环骨架进行羟基化和氧化等复杂修饰作用,是人参皂苷生物合成途径中的关键酶。近年来利用新一代测序技术及生物信息学分析等方法, 筛选出了参与人参皂苷生物合成的相关 CYP450, 并对候选基因进行了生物功能验证, 进一步阐明了人参皂苷生物合成途径[55]。Han 等[56]对茉莉酸甲酯诱导的人参不定根进行了转录组测序, 通过拼接、注释及扩增得到 9 个候选 CYP450 全长基因。其中 CYP716A47基因不仅可响应茉莉酸甲酯诱导表达量上调, 而且转入过量表达 SS 基因的转基因人参植株后能使人参根中皂苷的产量提高。将 CYP716A47 基因转入酿酒酵母, 表达的重组蛋白能催化达玛烯二醇-II 的C-12 位羟基化而使其转化为原人参二醇。将 DS 与CYP716A47 同时转入酿酒酵母, 重组菌株中检测到了原人参二醇的产生。该报道首次对参与人参皂苷合成的 CYP450 进行了功能确证。陈士林[57]课题组应用高通量 454GS FLX 测序技术进行人参、西洋参和三七转录组研究, 在大量的转录组数据中挖掘CYP450,为进一步筛选参与人参皂苷合成的 CYP450 提供了重要依据。Sun 等[58]对西洋参根进行高通量测序, 通过拼接、注释得到 150 个 CYP450。选取其中转录水平最高的 27 个 CYP450 进行茉莉酸甲酯诱导实验,在根、茎、叶和花组织中仅 contig00248 转录本与 DS表达模式一致。转录本 contig00248 在系统进化上与拟南芥 CYP88 家族较近, 文章把 contig00248 转录本作为氧化达玛烯二醇-II 或原人参二醇的关键候选CYP450。Luo 等[59]对三七根进行高通量测序, 进而拼接、注释和扩增得到 15 个全长 CYP450。其中Pn00158 转录本与西洋参候选 CYP450 contig00248转录本具有极高的相似性, 并且与已进行功能确证的人参CYP716A47的氨基酸序列同源性高达97.95%,由此推断 Pn00158 极有可能是三七中参与人参皂苷合成的 CYP450。Han 等[60]从茉莉酸甲酯诱导的人参不定根 EST 文库中克隆到 CYP716A53v2, 将其转入酿酒酵母后表达的重组蛋白能催化原人参二醇的C-6 位羟基化而使其转化为原人参三醇。上述关于人参皂苷相关 CYP450 的研究进展, 大大推进了人参皂苷生物合成途径的研究, 也为通过合成生物学技术生产人参皂苷的探索提供了重要的元器件。

3.7 糖基转移酶 (GT) 

GT 催化的糖基化反应是人参皂苷生物合成的最后一步, 其主要过程是将核苷二磷酸活性糖分子转移到人参皂苷苷元底物上, 从而形成糖苷键。糖基化可以增加人参皂苷的稳定性和水溶性, 这一过程也决定了其多样性。GT 也是以基因家族的形式存在于植物体内, 具有高度的专一性。转移的糖基不同或糖基的受体不同, 所需的 GT 也不同。陈欣等[61]首次从人参毛状根中提取分离了一种GT, 用 SDS-PAGE 测定其分子质量为 56.6 kD, 并对其酶学特征进行了初步研究。Yue 等[62]从三七悬浮细胞中分离纯化了一种 GT, 能将 Rd 转化为 Rb-1。但迄今为止尚未有从人参属植物中克隆到 GT 基因的报道。糖基化是人参皂苷生物合成途径中最下游的步骤, 进行深入研究对选择性地获得具有较高价值的人参皂苷具有重要意义。

综上所述, 人参皂苷生物合成途径的基本框架及相关酶的研究已经取得了较大的进展。目前已从人参和西洋参等人参属植物中克隆到 20 多个编码人参皂苷生物合成相关酶的基因并进行了功能验证,为通过合成生物学技术生产人参皂苷提供了基本的生物元器件, 为该研究奠定了较好的基础。在验证人参皂苷生物合成相关关键酶基因功能时一般用酿酒酵母作为底盘细胞, 这是因为酿酒酵母具备作为一个优良底盘细胞所需的特征, 如能在营养成分简单的培养基上生长, 容易利用生化反应器放大生产规模, 有多个营养缺陷型供选择, 并有多个选择标记可使用, 尤其是酿酒酵母通过自身固有的 MVA 途径产生的 2, 3-氧化鲨烯正是合成人参皂苷的前体, 这为人参皂苷代谢途径在酿酒酵母中的组建提供了很大的便利。此外, 鉴于有些人参皂苷的糖基并不是发挥药理作用所必需的, 脱去所有糖基的人参皂苷苷元的药理活性反而比人参皂苷更强, 因此通过合成生物学途径直接获得人参皂苷苷元也具有非常重要的意义。
4 结语
人类日益增长的医药及研发需求使人参、西洋参及其皂苷成为研究热点, 上述几个方面的研究已取得了一些进展。除了人参和西洋参的人工种植以外,国内外报道的获取人参皂苷的几种途径还包括组织培养、生物转化和合成生物学技术等。组织培养是目
前解决药源问题的重要途径, 鉴于人参皂苷的代谢途径已经逐渐明晰, 因此可以通过基因工程技术提高关键酶基因的表达量以提高人参皂苷的合成水平,获得高产细胞株, 从而更加有效地缓解日益增长的医药及研发需求。生物转化在获取稀有人参皂苷及苷
元方面具有较为突出的优势, 而且还可能获得一些天然植物中不存在的人参皂苷类衍生物。人参皂苷的合成生物学研究也是一种具有广阔发展前景的途径。人参皂苷的生物合成是一个受多因素调节的复杂动态过程, 为了实现通过合成生物学途径生产人参皂苷的目标, 不仅要将克隆到的相关关键酶基因转入合适的底盘细胞, 通过人工改造这些基因使其异源高效表达, 还要对调控人参皂苷代谢网络的一些调控基因进行深度挖掘, 以找到开启整个代谢网络的开关, 从而整体提高整个代谢途径中基因的表达水平, 更加有效地提高人参皂苷的产量。迄今为止, 人参皂苷的合成生物学研究虽在生物元器件的获得及其功能验证方面有一些较大的进展, 但底盘细胞的改造、代谢途径的装配等研究刚刚起步, 所以相关学科应联合攻关, 共同推进这项研究的发展。
References
[1]
He DT, Wang B, Chen JM. Research progress on
pharmacological effects of ginsenosides [J]. J Liaoning
Univ Tradit Chin Med (辽宁中医药大学学报), 2012, 14:
118−121.
[2]
Christensen LP. Ginsenosides: chemistry, biosynthesis,
analysis, and potential health effects [J]. Adv Food Nutr Res,
2009, 55: 1−99.
[3]
Zuo BM, Gao WY, Dong YY, et al. Progress of the tissue
culture in medicinal plant Panax ginseng [J]. Mod Chin Med
(中国现代中药), 2012, 14: 34−37.
[4]
Liu H, Gao WY, Zuo BM, et al. Progress of the tissue culture
in Panax quinquefolium L. [J]. Mod Chin Med (中国现代中
药), 2012, 14: 1−4.
[5]
Gao WY, Jia W, Duan HQ, et al. Industrialization of medicinal
plant tissue culture [J]. China J Chin Mater Med (中国中药
杂志), 2003, 28: 385−390.
[6]
Yu KW, Cao WY, Hahn EJ, et al. Jasmonic acid improves
ginsenoside accumulation in adventitious root culture of Panax
ginseng C. A. Meyer [J]. Biochem Eng J, 2002, 11: 211−215.
[7]
Chen W, Gao WY, Jia W, et al. Advances in studies on tissue
and cell culture in medicinal plants of Panax L. [J]. Chin
Tradit Herb Drugs (中草药), 2005, 36: 616−620.
[8]
Dou DQ, Jin L, Chen YJ. Advances and prospects of the
study on chemical constituents and pharmacological activities
of Panax ginseng [J]. J Shenyang Pharm Univ (沈阳药科大
学学报), 1999, 16: 151−156.
[9]
Kobashi K. Relation of intestinal bacteria to pharmacological
effects of ginsenosides [J]. Biosci Microflora, 1997, 16: 1−7.
[10] Hasegawa H. Proof of the mysterious efficacy of ginseng:
basic and clinical trials: metabolic activation of ginsenoside
deglycosylation by intestinal bacteria and esterification with
fatty acid [J]. J Pharmacol Sci, 2004, 95: 153−157.
[11] Wang YZ, Chen J, Chu SF, et al. Improvement of memory
in mice and increase of hippocampal excitability in rats
by ginsenoside Rg1’s metabolites ginsenoside Rh1 and
protopanaxatriol [J]. J Pharmacol Sci, 2009, 109: 504−510.
[12] Liu X, Dai JG. Advances in the study of biotransformation
of ginsenosides [J]. Ginseng Res (人参研究), 2010, 22:
19−22.
[13] Zhang YX, Chen XY, Zhao WQ. Advances in studies on
biotransformation of ginsenosides [J]. J Shenyang Pharm
Univ (沈阳药科大学学报), 2008, 25: 419−422.
[14] Wang Y, Liu TH, Wang W, et al. Research on the transformation
of ginsenoside Rg1 by intestinal flora [J]. China J Chin
Mater Med (中国中药杂志), 2001, 26: 188−190.
[15] Bae EA, Choo MK, Park EK, et al. Metabolism of ginsenoside
R(c) by human intestinal bacteria and its related antiallergic
activity [J]. Biol Pharm Bull, 2002, 25: 743−747.
[16] Bae EA, Han MJ, Choo MK, et al. Metabolism of 20(S)- and
20(R)-ginsenoside Rg3 by human intestinal bacteria and its
relation to in vitro biological activities [J]. Biol Pharm Bull,
2002, 25: 58−63.
[17] Cui YN, Zhang YX, Zhao YQ. Advances in studies on
preparation of rare ginsenosides by biotransformation [J].
Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2009, 40: 676−680.
[18] Dong AL, Cui YJ, Guo HZ, et al. Microbiological transformation
of ginsenoside Rg1 [J]. J Chin Pharm Sci, 2001, 10: 114−
118.
[19] Fu JG. Study on the Microbiological Transformation of
Ginsenoside (人参皂苷微生物转化的研究) [D]. Changchun:
Jilin Agricultural University, 2004.
[20] Cheng LQ, Kim MK, Lee JW, et al. Conversion of major
ginsenoside Rb1 to ginsenoside F2 by Caulobacter leidyia [J].
Biotechnol Lett, 2006, 28: 1121−1127.
[21] Bao HY, Li L, Zan LF, et al. Ginsenosides Re biotransformation
by Rhizopus sp [J]. Mycosystema (菌物学报), 2010, 29:
548−554.
[22] Cui Y, Jiang BH, Han Y, et al. Microbial transformation
on ginsenoside compound K from total saponins in fruit of
Panax ginseng [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2007,
38: 189−193.
[23] Liu X, Qiao LR, Xie D, et al. Microbial deglycosylation
and ketonization of ginsenosides Rg1 and Rb1 by Fusarium
oxysporum [J]. J Asian Nat Prod Res, 2011, 13: 652−658.
[24] Liu X, Qiao LR, Xie D, et al. Microbial transformation of
ginsenosides-Rg1 by Absidia coerulea and the reversal activity
of the metabolites towards multi-drug resisitant tumor cells [J].
Fitoterapia, 2011, 82: 1313−1317.
[25] Ko SR, Choi KJ, Suzuki K, et al. Enzymatic preparation of
ginsenosides Rg2, Rh1, and F1 [J]. Chem Pharm Bull, 2003,
51: 404−408.
[26] Ko SR, Suzuki Y, Suzuki K, et al. Marked production of
ginsenosides Rd, F2, Rg3, and compound K by enzymatic
method [J]. Chem Pharm Bull, 2007, 55: 1522−1527.
[27] Liu L, Zhu XM, Wang QJ, et al. Enzymatic preparation of
20(S, R)-protopanaxadiol by transformation of 20(S, R)-Rg3
from black ginseng [J]. Phytochemistry, 2010, 71: 1514−
1520.
[28] Liu L, Gu LJ, Zhang DL, et al. Microbial conversion of rare
ginsenoside Rf to 20(S)-protopanaxatriol by Aspergillus niger
[J]. Biosci Biotechno1 Biochem, 2010, 74: 96−100.
[29] Kim DS, Cue YS, Yu HS, et al. Ginsenoside Rh2 prepared
from enzyme reaction [J]. J Dalian Inst Light Ind (大连轻工
学院学报), 2002, 21: 112−115.
[30] Noh KH, Son JW, Kim HJ, et al. Ginsenoside compound
K production from ginseng root extract by a thermostable
beta-glycosidase from Sulfolobus solfataricus [J]. Biosci
Biotechno1 Biochem, 2009, 73: 316−321.
[31] Yoo MH, Yeom SJ, Park CS, et al. Production of aglycon
protopanaxadiol via compound K by a thermostable β-glycosidase
from Pyrococcus furiosus [J]. Appl Microbiol Biotechnol,
2011, 89: 1019−1028.
[32] Chen SL, Zhu XX, Li CF, et al. Genomics and synthetic
biology of traditional Chinese medicine [J]. Acta Pharm Sin
(药学学报), 2012, 47: 1070−1078.
[33] Wang W, Meng C, Zhu P, et al. Preliminary study on
metabolic engineering of yeast for producing taxadiene [J].
China Biotechnol (中国生物工程杂志), 2005, 25: 103−108.
[34] Ajikumar PK, Xiao WH, Tyo KE, et al. Isoprenoid pathway
optimization for taxol precursor overproduction in Escherichia
coli [J]. Science, 2010, 330: 70−74.
[35] Kong JQ, Wang W, Wang LN, et al. The improvement of
amorpha-4,11-diene production by a yeast-conform variant [J].
J Appl Microb, 2009, 106: 941−951.
[36] Westfall PJ, Pitera DJ, Lenihan JR, et al. Production of
amorphadiene in yeast, and its conversion to dihydroartemisinic
acid, precursor to the antimalarial agent artemisinin [J]. Proc
Natl Acad Sci USA, 2012, 109: E111−118.
[37] Wu Q, Zhou YQ, Sun C, et al. Progress in ginsenosides
biosynthesis and prospect of secondary metabolic engineering
for the production of ginsenosides [J]. China Biotechnol
(中国生物工程杂志), 2009, 29: 102−108.
[38] Ming QL, Han T, Huang F, et al. Advances in studies on
ginsenoside biosynthesis and its related enzymes [J]. Chin
Tradit Herb Drugs (中草药), 2010, 41: 1913−1917.
[39] Wu Q, Sun C, Chen SL. Identification and expression
analysis of a 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase
gene from American ginseng [J]. Plant Omics J, 2012, 5:
414−420.
[40] Kim OT, Bang KH, Jung SJ, et al. Molecular characterization
of ginseng farnesyl diphosphate synthase gene and its up-
regulation by methyl jasmonate [J]. Biol Plant, 2010, 54:
47−53.
[41] Ali MB, Yu KW, Hahn EJ, et a1. Methyl jasmonate and
salicylic acid elicitaion induces ginsenosides accumulation,
enzymatic and non-enzymatic anti-oxidant in suspension
culture Panax ginseng roots in bioreactors [J]. Plant Cell
Rep, 2006, 25: 613−620.
[42] Kim OT, Kim SH, Ohyama K, et al. Upregulation of phytosterol
and triterpene biosynthesis in Centella asiatica hairy roots
overexpressed ginseng farnesyl diphosphate synthase [J].
Plant Cell Rep, 2010, 29: 403−411.
[43] Lee MH, Jeong JH, Seo JW, et al. Enhanced triterpene
and phytosterol biosynthesis in Panax ginseng overexpressing
squalene synthase gene [J]. Plant Cell Physiol, 2004, 45:
976−984.
[44] Kim TD, Han JY, Huh GH, et al. Expression and functional
characterization of three squalene synthase genes associated
with saponin biosynthesis in Panax ginseng [J]. Plant Cell
Physiol, 2011, 52: 125−137.
[45] Seo JW, Jeong JH, Shin CG, et a1. Over expression of
squalene synthase in Eleutherococcus senticosus increases
phytosterol and triterpene accumulation [J]. Phytochemistry,
2005, 66: 869−877.
[46] Jiang SC, Zhang MZ, Wang Y, et al. Interference vector
construction of Panax ginseng’ SQS gene and transformation
callus [J]. J Jilin Univ (吉林大学学报), 2011, 49: 1136−
1140.
[47] Han JY, In JG, Kwon YS, et al. Regulation of ginsenoside
and phytosterol biosynthesis by RNA interferences of squalene
epoxidase gene in Panax ginseng [J]. Phytochemistry, 2010,
71: 36−46.
[48] Jiang SC, Liu WC, Wang Y, et al. Correlation between
ginsenoside accumulation and SQS and SQE gene expression
in different organs of Panax quinquefolius [J]. Chin Tradit
Herb Drugs (中草药), 2011, 42: 579−584.
[49] Kushiro T, Ohno Y, Shibuya M, et a1. In vitro conversion
of 2, 3-oxidosqualene into dammarenediol by Panax ginseng
microsomes [J]. Biol Pharm Bull, 1997, 20: 292−294.
[50] Tansakul P, Shibuya M, Kushiro T, et al. Dammarenediol-II
synthase, the first dedicated enzyme for ginsenoside biosynthesis,
in Panax ginseng [J]. FEBS Lett, 2006, 580: 5143−5149.
[51] Han JY, Kwon YS, Yang DC, et al. Expression and RNA
interference-induced silencing of the dammarenediol synthase
gene in Panax ginseng [J]. Plant Cell Physiol, 2006, 47:
1653−1662
[52] Lee MH, Han JY, Kim HJ, et al. Dammarenediol-II production
confers TMV tolerance in transgenic tobacco expressing Panax
ginseng dammarenediol-II synthase [J]. Plant cell Physiol,
2011, 53: 173−182.
[53] Kushiro T, Shibuya M, Ebizuka Y. β-Amyrin synthase
cloning of oxidosqualene cyclase that catalyzes the formation
of the most popular triterpene among higher plants [J]. Eur J
Biochem, 1998, 256: 238−244.
[54] Zhao SJ, Hou CX, Liang YL, et al. Cloning of ginseng β-AS
gene and the construction of its antisense plant expression
vector [J]. China Biotechnol (中国生物工程杂志), 2008,
28: 74−77.
[55] Niu YY, Luo HM, Huang LF. Advances in the study of
CYP450 involves in ginsenosides biosynthesis [J]. World Sci
Technol/Mod Tradit Chin Med Mater Med (世界科学技术—
中医药现代化), 2012, 14: 1177−1183.
[56] Han JY, Kim HJ, Kwon YS, et al. The Cyt P450 enzyme
CYP716A47 catalyzes the formation of protopanaxadiol from
dammarenediol-II during ginsenoside biosynthesis in Panax
ginseng [J]. Plant Cell Physiol, 2011, 52: 2062−2073.
[57] Chen SL, Luo HM, Li Y, et al. 454 EST analysis detects
genes putatively involved in ginsenoside biosynthesis in Panax
ginseng [J]. Plant Cell Rep, 2011, 30: 1593−1601.
[58] Sun C, Li Y, Wu Q, et al. De novo sequencing and analysis
of the American ginseng root transcriptome using a GS FLX
Titanium platform to discover putative genes involved in
ginsenoside biosynthesis [J]. BMC Genomics, 2010, 11:
262−273.
[59] Luo HM, Sun C, Sun YZ, et al. Analysis of the transcriptome
of Panax notoginseng root uncovers putative triterpene saponin –
biosynthetic genes and genetic markers [J]. BMC Genomics,
2011, 12: S5.
[60] Han JY, Hwang HS, Choi SW, et al. Cytochrome P450
CYP716A53v2 catalyzes the formation of protopanaxatriol
from protopanaxadiol during ginsenoside biosynthesis in
Panax ginseng [J]. Plant Cell Physiol, 2012, 53: 1535−1545.
[61] Chen X, Xue Y, Liu JH, et al. Purification and characterization
of glucosyltransferase from Panax Ginseng hairy root cultures
[J]. Pharm Biotechnol (药物生物技术), 2009, 16: 50−54.
[62] Yue CJ, Zhong JJ. Purification and characterization of UDPG:
ginsenoside Rd glucosyltransferase from suspended cells of
Panax notoginseng [J]. Proc Biochemistry, 2005, 40: 3742−
3748

  本文关键词：人参皂苷生物合成研究进展，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：55329