独一味石油醚提取物对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株增殖的影响及其机制研究

发布时间：2017-08-10 05:04

  本文关键词：独一味石油醚提取物对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株增殖的影响及其机制研究

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【摘要】：目的:1.探讨独一味石油醚提取物(petroleum ether extract of Lamiophlomis rotate,PEELR)对Tca8113细胞株细胞活性及增殖能力的影响。2.探讨独一味石油醚提取物对Tca8113细胞株细胞克隆形成能力的影响。3.探讨独一味石油醚提取物对Tca8113细胞株细胞凋亡的影响。4.探讨独一味石油醚提取物对小鼠成纤维小包L929细胞株细胞毒性的影响。5.探讨独一味石油醚提取物对Tca8113细胞株细胞周期的影响。6.探讨独一味石油醚提取物对Tca8113细胞株细胞中BAX,Bcl-2与Casepase3的蛋白表达量的影响。方法:通过磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)比色法、生长能力观察、细胞克隆形成实验、Annexin V/PI双染检测细胞凋亡和流式细胞术来检测Tca8113细胞株的细胞生长能力、增殖活力及凋亡比例,设置独一味石油醚提取物(petroleum ether extract of Lamiophlomis rotate,PEELR)实验组、空白对照组,以博来霉素(bleomycin,BLM,10μg/mL)作为药物对照组,以小鼠成纤维细胞L929细胞株作为细胞对照组检测PEELR毒性。经Hoechst/PI双染法观察Tca8113细胞株细胞形态、细胞总数及凋亡、坏死细胞比例。经细胞周期检测分析细胞周期阻滞情况。蛋白免疫印迹法(Western blot)对Tca8113细胞中P53,BAX,Bcl-2与Casepase3蛋白表达量进行检测。结果:1.24 h SRB比色法和Tca8113细胞株生长曲线结果显示:24 h的IC50=66.388μg/mL,PEELR药物浓度与对Tca8113细胞的增殖抑制率呈正相关;低浓度PEELR(25μg/m L和50μg/mL)对Tca8113细胞的生长能力与空白对照组相比无明显差异(P0.05);中浓度PEELR(100μg/mL)和高浓度PEELR药物(200μg/m L和400μg/m L)对Tca8113细胞株的长期增殖抑制作用与对照药物组BLM(10μg/m L)相比差异无统计学意义(P0.05)2.细胞克隆形成实验表明:随着PEELR浓度的增大,Tca8113细胞株细胞的克隆形成率(即增殖能力)逐渐减小;不同浓度PEELR药物对Tca8113细胞株细胞均有显著的增殖抑制效果(P0.01);中浓度PEELR(100μg/m L)和高浓度PEELR药物(200μg/m L)对Tca8113细胞株的克隆形成能力与对照药物组BLM(10μg/m L)相比差异无统计学意义(P0.05)。3.Annexin V/PI双染细胞凋亡比例检测显示:PEELR可以诱导Tca8113细胞株细胞发生凋亡;PEELR浓度与诱导凋亡能力呈正相关;与BLM(10μg/m L)组相比,PEELR组(50μg/mL和100μg/mL)无显著差异(P0.05);与空白对照组相比,PEELR组的Tca8113细胞系晚期凋亡和坏死发生率均有极其显著差异(P0.01);与BLM(10μg/m L)组相比PEELR组的Tca8113细胞系晚期凋亡和坏死发生率均有显著差异(P0.05)。而不同浓度PEELR组相比均无显著差异(P0.05)。4.细胞毒性试验显示:24 h的IC50=294.119μg/mL;低、中浓度PEELR对L929细胞系的影响与空白对照组,药物对照组相比无明显差异(P0.05);高浓度PEELR对L929细胞系有抑制作用,呈正相关。5.随着PEELR药物浓度的增加,同一视野范围内细胞总数呈负相关,而凋亡、坏死细胞比例呈正相关。PEELR组正常细胞无明显形态的变化,凋亡细胞可见细胞核皱缩,PEELR组凋亡细胞比率显著大于坏死细胞比率(P0.01)。6.随着PEELR药物浓度的增大,其作用24 h的Tca8113细胞系细胞周期的SPF指数和PI增殖指数均减小。7.Western blt实验结果显示:BAX和Casepase-3的蛋白表达量随PEELR药物浓度增大而增大,Bcl-2的蛋白表达量随PEELR药物浓度增大而减小。PEELR各个药物组均可以降低Bcl-2/BAX表达比率,差异具有统计学意义(P0.01);Bcl-2/BAX表达比率的大小与PEELR药物浓度呈负相关;高浓度PEELR(150μg/mL、200μg/mL)组的Bcl-2/BAX表达比率小于1。结论:PEELR对体外培养的人舌鳞癌细胞的增殖有较好的抑制效果,且无明显的细胞毒性。PEELR可能是通过内源性凋亡通路,以上调BAX和Casepase-3的蛋白表达量和下调Bcl-2的蛋白表达量来引起线粒体外膜通透性增加和诱导细胞色素c的释放从而发挥了抑制Tca8113细胞株增殖及诱导其发生凋亡的作用。
【关键词】：独一味石油醚提取物 人舌鳞状细胞癌 肿瘤细胞增 SRB比色法 细胞克隆形成实验 流式细胞术 BAX Bcl-2 Casepase3
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R29
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-12
• 第一章 藏药独一味的研究进展12-20
• 1 独一味简介12-13
• 2 独一味化学成分的研究概述13-16
• 2.1 黄酮类成分13
• 2.2 环烯醚萜类化合物13-14
• 2.3 苯乙醇苷类化合物14-15
• 2.4 挥发油类成分15-16
• 2.5 其它类成分16
• 3 独一味药理活性及临床应用研究概述16-19
• 3.1 镇痛、抗炎作用16-17
• 3.2 止血作用17-18
• 3.3 抗菌作用18
• 3.4 提高免疫功能作用18
• 3.5 抗肿瘤作用18-19
• 3.6 毒理毒性作用19
• 4 独一味研究小结19-20
• 第二章 独一味石油醚提取物对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株增殖的影响20-36
• 1 口腔癌的现状20-24
• 1.1 口腔癌的流行病学研究20-22
• 1.1.1 口腔癌的发病率跟死亡率20-21
• 1.1.2 口腔癌的生存率21
• 1.1.3 口腔癌的发病趋势21-22
• 1.1.4 口腔癌的治疗22
• 1.2 中药及其提取物抗肿瘤的研究22-23
• 1.3 独一味防治肿瘤的进展23-24
• 2 材料与方法24-27
• 2.1 材料24-25
• 2.1.1 独一味石油醚提取物的提取24
• 2.1.2 实验用细胞株来源24
• 2.1.3 主要试剂24-25
• 2.1.4 主要仪器和设备25
• 2.2 方法25-27
• 2.2.1 细胞的培养25-26
• 2.2.2 SRB比色法测定PEELR对Tca8113细胞株生长能力的影响26
• 2.2.3 PEELR对Tca8113细胞株生长曲线的影响26
• 2.2.4 PEELR对Tca8113细胞株克隆形成能力的影响26-27
• 2.2.5 Annexin V荧光探针和流式细胞仪检测PEELR对Tca8113细胞凋亡的影响27
• 2.2.6 PEELR对小鼠成纤维细胞株L929细胞毒性的影响27
• 2.2.7 统计学处理27
• 3 结果27-34
• 3.1 Tca8113细胞株正常形态27-28
• 3.2 SRB比色法检测不同浓度的PEELR和 10 μg/m L的BLM作用24 小时对Tca8113细胞系生长能力的影响28-29
• 3.3 SRB比色法检测PEELR对Tca8113细胞系生长曲线的影响29-30
• 3.4 PEELR对Tca8113细胞系克隆形成能力的影响30-32
• 3.5 PEELR对Tca8113细胞系凋亡率的影响32-33
• 3.6 PEELR对L929细胞株细胞毒性的影响33-34
• 4 讨论34-36
• 第三章 独一味石油醚提取物对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株BAX、bcl-2 和Casepase3蛋白表达的影响36-50
• 1 前言36-37
• 2 材料与方法37-42
• 2.1 材料37-38
• 2.1.1 PEELR的提取37
• 2.1.2 实验用细胞株来源37
• 2.1.3 主要试剂37-38
• 2.1.4 主要仪器和设备38
• 2.2 方法38-42
• 2.2.1 细胞的培养38
• 2.2.2 Hoechst/PI荧光染色观察细胞形态38-39
• 2.2.3 流式细胞术检测PEELR对Tca8113细胞周期的影响39
• 2.2.4 Western blot法检测PEELR药物组Tca8113细胞BAX，Bcl-2，，Casepase-3 蛋白的表达39-41
• 2.2.5 统计学处理41-42
• 3 结果42-47
• 3.1 Hoechst/PI荧光染色观察细胞形态42-44
• 3.2 流式细胞术检测PEELR对Tca8113细胞周期的影响44-45
• 3.3 Western blot法检测PEELR药物组Tca8113细胞株BAX、Bcl-2、Casepase-3 蛋白的表达45-47
• 3.3.1 Western blot法检测PEELR药物组Tca8113细胞株BAX、Bcl-2、Casepase-3 蛋白的表达45-46
• 3.3.2 PEELR药物组Tca8113细胞株Bcl-2/ BAX蛋白表达比率的影响46-47
• 4 讨论47-50
• 第四章 结论50-52
• 第五章 展望52-54
• 参考文献54-60
• 中英文对照60-61
• 在学期间主要研究成果61-62
• 病例报告62-69
• 1）病历摘要62-63
• 2）术前准备及注意事项63
• 3）手术过程：上颌骨部分切除术+左侧舌骨上淋巴结清扫术63-64
• 4）术后管理64
• 5）出院诊断64-66
• 6）病例讨论与文献回顾66-69
• 1. 诊断与鉴别诊断66-68
• 2. 患者术式的选择68-69
• 致谢69

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