液质联用技术在丹参成分分析中的应用

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中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第45卷 第23期 2014年12月

液质联用技术在丹参成分分析中的应用

王 洋1，陈 涛1，潘 霖2，李 正1，崔维利1，李 进1*

1. 天津中医药大学第一附属医院，天津 300193 2. 天津第一中心医院，天津 300192

摘 要：丹参在中医临床中的应用历史悠久，其治疗作用广泛，特别是在治疗心血管疾病时具有独特的疗效。丹酚酸及丹参酮类成分是丹参中的主要药效成分，因其显著的生物活性备受关注。液质联用技术（LC-MS）是集分离与分析于一体的具有快速、高灵敏度特点的综合分析方法，现已广泛用于中药成分分析中。通过对国内外文献进行系统整理，对LC-MS技术在丹参有效成分分析中的应用进行总结，以期为科学阐释丹参药效物质基础、提高质量控制标准、合理利用丹参药材及含丹参中药制剂提供参考。

关键词：丹参；丹酚酸；丹参酮；液质联用；质量控制

中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)23 - 3494 - 09 DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.23.025

Application of liquid chromatography coupled with mass spectrometry technique in component analysis of Salvia miltiorrhiza

WANG Yang1, CHEN Tao1, PAN Lin2, LI Zheng1, CUI Wei-li1, LI Jin1

1. First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China 2. Tianjin First Center Hospital, Tianjin 300192, China

Abstract: Salvia miltiorrhiza (Danshen) is a kind of Chinese materia medica (CMM), and there has been a long history of Danshen for wide use in the treatment of numerous diseases, especially the unique therapeutic effect on cardiovascular disorders. Salvianolic acids and tanshinones are the main effective components in Danshen, which attracts the researchers’ more attention for its significant biological activity. Liquid chromatography coupled with mass spectrometry technique (LC-MS) is a rapid, sensitive, and comprehensive analytical method for the simultaneous separation and analysis, which has been widely used in the study on CMM component analysis. A large number of literatures of the application of LC-MS in the component analysis of Danshen are systematically summarized in this paper, so as to provide some indication for scientific interpretation of the effective material basis, and improve the quality control standard and comprehensive utilization of Danshen and its preparation.

Key words: Salvia miltiorrhiza Bunge; salvianolic acids; tanshinones; liquid chromatography coupled with mass spectrometry technique; quality control

中药是由多种化学成分所组成的复杂混合体系，并且中医用药经常采用多种药物配伍组成复方，这就给深入、系统的研究中药成分带来了巨大的挑战。丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根和根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痛的功效[1]。近年来，丹参及含丹参收稿日期：2014-07-17

基金项目：天津市科技创新专项资金项目（06FZZDSH00408）；天津市西青区科技创新专项计划项目（XQCXZX2012-006）；天津市西青区科

技型中小企业发展专项资金项目（XQKC2013-022）

作者简介：王 洋（1981—），男，博士，主管药师，研究方向为中药体内外药物分析和中药药理学。

Tel: (022)83969680 E-mail: dayang810025@163.com

*通信作者 李 进 Tel: (022)83969822 E-mail: lijin@shitian.com

中药制剂因为显著的治疗作用，特别是在心血管疾病治疗领域，越来越为人们所关注[2]，众多科学工作者从化学、药理学、临床应用、安全性评价及质量控制等方面对丹参进行了大量的研究[3]。液质联用技术（LC-MS）集中体现了液相色谱（LC）高效的分离能力和质谱（MS）强大的结构鉴定能力，为

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混合物的快速、准确分析提供了一种有效的手段，现已广泛地应用于中药化学成分分析[4]，MS对于中药中已知物的快速定性及未知物的识别均具有极强的选择性。电喷雾电离（ESI）和大气压化学电离（APCI）为LC-MS最主要的2种离子源。LC-MS最常用的在线检测器包括：三重四级杆（TQ或、傅里叶变换离子回MS/MS）、离子阱（IT或MSn）旋共振（FTICR）、飞行时间（TOF）等。其中，TQ主要用于定量分析，IT可以提供母离子和子离子之间的多极质谱数据，FTICR及TOF可以提供高分辨质谱数据及化合物的元素组成[5]。此外还包括常与LC连接用于定量分析的紫外检测器（UV或DAD）、蒸发光散射检测器（ELSD）以及电化学检测器（ED）等。近年来，基于现代仪器分析技术的丹参及含丹参中药制剂中有效成分的体内外分析有了很大的进展，主要方法包括LC、超高效液相色谱法（UPLC

HO

HO

COOH

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或UFLC）、薄层色谱（TLC）、气相色谱（GC）、红外光谱（IR）及LC-MS等。本文将对近年来国内外有关采用LC-MS技术分析丹参有效成分的文献进行系统的整理，对丹参有效成分分析的研究进展进行综述。 1 体外成分分析 1.1 丹参有效成分分析

目前，已从丹参药材中分离出70多种化合物，主要包括水溶性的酚酸类成分和脂溶性的二萜醌类成分（主要成分结构信息见图1），其中酚酸类成分是主要的活性成分[3]，对丹参药材中酚酸类成分的分析都在负离子模式下进行，并且多采用ESI的方式离子化[5]，而二萜醌类成分则采用正离子模式[6-11]。丹酚酸B和丹参酮IIA作为最主要的活性成分，常作为丹参药材及含丹参中药制剂质量控制的标志物[1]。

CHO

HO

O

咖啡酸

丹参素

HO

原儿茶醛

原儿茶酸

OH

隐丹参酮

HO

HOO

OHHO

丹酚酸A丹酚酸B

丹参酮 IIA

OH

HOHOHO

HOHO

丹酚酸C

丹酚酸D

二氢丹参酮 I

O

HOHO

HOHO

COOH

OH迷迭香酸

丹参酮 I

图1 丹参中主要化学成分结构

Fig. 1 Structures of main chemical constituents in S. miltiorrhiza

Zeng等[12]通过LC/ESI-MS/MS对丹参药材中酚酸类成分进行了分析。采用TQ作为检测器，，发现咖啡酸及其同系物包含一个容易脱掉CO2的羧基，并确定了提取物中28种成分。宋敏等[13]通过LC建立了丹参脂溶性成分指纹图谱，利用

LC-MS/MS对主要特征指纹峰进行了分析，共鉴定出6个化合物。唐小峦等[14]通过LC-UV-MS/MS法分析丹参不同极性提取物，共鉴定出14个成分，并对其中的4个成分进行了定量分析，为相关的谱-效学研究奠定了良好的基础。

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IT-MS属于时间上的串联质谱，可以提供多级离子碎片，确定化合物的裂解规律，对于化合物的定性分析具有重要意义。Liu等[15]通过LC-IT-MS对丹参药材的酚酸类成分进行了定性分析，共鉴定42个酚酸类成分，其中16个为首次发现，说明IT比TQ更适合中药有效成分的定性分析。沈建芳等[8]通过并建立了LC-IT-MS探讨丹参酮IIA的质谱裂解规律，丹参酮部位特征图谱，对特征图谱中11种主要化合物进行了归属。董昕等[9]通过LC-IT-MS对丹参药材中的水溶性及脂溶性成分进行较为全面的质谱行为考察，分别对8个丹参对照品进行了多级质谱裂解分析，并总结了丹参酚酸类和丹参酮类成分的裂解规律，根据裂解规律对药材中的目标成分进行归属。赵新锋等[16]利用超临界萃取仪（SCFE）获得丹参总提物，采用LC-IT-MS对总提物的化学成分进行分析，确定了15种化学成分，其中2种为未知成分。韩凤梅等[17]通过LC-IT-MS研究脂溶性丹参酮类成分的裂解规律，建立了脂溶性丹参酮类成分提取物的特征图谱。脂溶性丹参酮类物质具有相似的ESI-MS行为，裂解规律可用于鉴别丹参脂溶性化合物。

TOF也被有效地应用于丹参酚酸类成分分析中，通过获得的准确相对分子质量及分子式数据库，大量的化合物得到了确认[18-19]。于文佳等[10]利用LC-TOF-MS对丹参脂溶性成分进行了定性分析，共鉴定15个脂溶性成分。刘劼等[11]通过LC-TOF-MS研究二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮和丹参酮IIA的分子结构与MS裂解规律间的关系，并对丹参提取物中的脂溶性成分进行鉴定。结果表明4种化合物因为相似的结构而具有相似的裂解规律，该规律被认为是二萜醌类结构的特征裂解规律。通过TOF提供的精确相对分子质量，共鉴定出16个丹参酮类成分。Zhou等[20]通过LC-TOF-MS对丹参脂溶性成分进行了分析，共鉴定出21个成分，并对其中的12个成分进行了定量分析。Song等[21]采用主成分分析（PCA）与UPLC-UV-TOF-MS相结合的方法，对丹参进行了质量控制方面的研究。通过PCA技术筛选质控标志物，再通过TOF-MS对这些标志物进行准确的定性，结合抗氧化活性筛选，最终制定了与生物活性相关的丹参质量控制方法。董倩倩等[22]建立靶细胞提取与LC/ESI-TOF-MS分析相结合进行丹参活性成分研究的方法，对丹参中可能的活性成分进行了推测。在不同细胞提取液中发现7个水溶性成

分。此外，还有一些研究通过单次进样同时分析了水溶性成分与脂溶性成分[23-25]。 1.2 含丹参中药制剂成分分析

近年来在临床中经常使用的、疗效确切的含丹参中药制剂品种越来越多，主要包括复方丹参滴丸、丹参注射液、香丹注射液等，通过LC-MS技术可以对这些制剂的物质组成、含量分布进行系统研究。Zhang等[26]建立了丹参注射液的LC-MS指纹图谱及代谢指纹图谱，从注射液中鉴定出11种丹参酚酸类成分，体内结果表明注射给药后丹参素、丹酚酸B消除迅速，紫草酸、丹酚酸A/D消除缓慢，并且在注射给药后30 min内一直维持相对较高的血药浓度，上述结果说明酚酸类成分可能是丹参注射液中最主要的生物活性成分。Liu等[23]建立了4种含丹参制剂（复方丹参片、丹参滴丸、丹参注射液、香丹注射液）的LC-MSn指纹图谱，共鉴定水溶性及脂溶性成分34个。章弘扬等[27]采用LC-TOF-MS结合LC-MSn对复方丹参滴丸的化学组成进行了分析，共鉴定出来自丹参的成分8个。韦英杰等[28]采用LC-MSn对复方丹参方的化学成分进行分析，共鉴定来自丹参中的成分23个。马晓红等[29]通过LC-MSn从复方丹参片中鉴定出来自丹参的成分6个。胡兴江等[30]通过LC-MS技术研究丹参与丹皮配伍的化学成分，鉴定并归属配伍煎液中19个成分，其中11个来自丹参，8个来自丹皮，配伍后丹参酚酸类、芍药苷类成分的量高于单煎，而鞣质的量降低。傅俊曾等[31]采用LC-MS/MS技术对芪参益气滴丸中丹参有效成分丹参素、原儿茶醛进行了定量分析，为该药的质量控制提供了依据。 2 体内成分分析

中药多采用口服的方式给药，机体对药物的处置可分为吸收、分布、代谢及排泄4个相互关联的过程，从血清药理学的角度出发药物口服后只有被血液吸收的成分才有可能成为真正的有效成分[32]。因此，通过LC-MS研究中药有效成分的体内过程对于明确药效物质基础及解释和预测疗效和毒副作用，制定合理的给药方案是非常必要的。 2.1 丹参有效成分的体内分析

对丹参有效成分的体内研究主要集中在药动学、组织分布、代谢等方面。丹酚酸B在体内可以产生多种代谢产物[33-35]，通过LC-MS/MS技术可以对丹酚酸B及其代谢产物的药动学特征进行分析[34]。Xu等[35]通过LC-MSn分析了丹酚酸B口

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服给予正常/抗菌治疗大鼠后，胆汁和尿液中的代谢产物。正常大鼠的胆汁中发现了4个代谢产物，粪便中有5个，并且在尿液中首次分离出2个新的代谢产物。而在抗菌治疗大鼠的胆汁和尿液中没有发现丹酚酸B的代谢产物，粪便中发现丹酚酸B的原型物。结果表明，肠道菌群在丹酚酸B的吸收、代谢和排泄过程中发挥着重要的作用。丹酚酸

B可能的体内代谢途径见图2[35]。

隐丹参酮具有显著的杀菌作用，其在体内可以迅速地转化为丹参酮IIA[36]，已有研究通过LC-MS/MS对二者的体内药动学过程进行了分析[36-37]。Sun等[38]通过LC/ESI-DAD-MSn对丹参脂溶性提取物（TTE-50）及其在大鼠胆汁内的代谢产物进行了定性

分析，共鉴定16个丹参酮类化合物及17个I相代谢

H33

H33

图2 丹酚酸B的体内代谢过程

Fig. 2 In vivo metabolic pathways of salvianolic acid B

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产物。代谢物转化主要发生在丹参酮IIA C-4位侧链，（PF2401-SF）口服给予大鼠后，丹参酮I、二氢丹参其中从甲基转化为伯醇基再转化为醛基为首次发现。Park等[39]通过LC-MS/MS对丹参标准提取物

酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮的药动学特征进行了研究。丹参酮IIA可能的体内代谢途径见图3[38]。

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图3 丹参酮ⅡA的体内代谢过程

Fig. 3 In vivo metabolic pathways of tanshinone IIA

Sun等[40]采用LC-MS对丹酚酸A在比格犬体内的药动学特征进行了分析，结果表明丹酚酸A口服后吸收迅速、并且具有较高的清除率及绝对生物利用度低的特点。Cui等[41]通过LC-MS/MS对紫草酸B的药动学特征及其代谢产物进行了分析，在肝细胞培养液、血、尿及胆汁中均发现4个相同的代谢产物，鉴定结果表明甲基化作用是其代谢的主要路径。裴渭静等[42]通过LC-MSn对人血清中的丹参素及其代谢产物进行了研究，发现其主要代谢产物为乙酰化的丹参素。通过LC-MS/MS对Beagle犬血浆中丹参素含量进行测定，发现口服或静脉给予丹参素后血药浓度的达峰时间均在1 h内[43]。张群正等[44]采用LC-MSn对口服丹参滴丸后产生的活性代谢产物丹参素异丙酯的吸收及组织分布进行了系采用LC-MS/ 统分析。丁建刚等[45]以地西泮为内标，MS方法，建立Beagle犬血浆中丹参酮IIA的测定方法。

丹参中包含多种类型的化合物，单一成分并不能反映药材的整体特征，因此多成分分析对于明确丹参药材的作用特点具有重要的意义。林力等[46]采用LC-MS/MS方法建立了同时检测Beagle犬血浆中丹酚酸D、丹酚酸B、紫草酸和迷迭香酸的分析方法，并对丹参提取物中4种化合物的药动学特征进行了分析。Li等[47]建立了一种同时测定人血清中6种水溶性成分的LC-MS/MS方法，该法可以用于丹参注

射液中该6种成分的药动学研究。Liu等[48]给大鼠口服丹参提取物，通过LC-MS/MS技术建立了一种同时测定血浆中丹参水溶性成分（丹参素、迷迭香酸）与脂溶性成分（隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮I、二氢丹参酮I）的方法，并对6种成分的药动学参数进行了计算，实现了2类成分的同时测定。 2.2 丹参制剂中有效成分的体内分析

与化学药物相比，中药产品中含有大量的化学成分，特别是多种中药配伍组成的复方，复方中多种药物之间可以通过不同的配伍关系而发挥协同增效或减毒等作用。复方的治疗作用与其中所含各种化学成分的协同作用密切相关。一种中药成分具有药物的属性必须满足以下3个条件：（1）广泛的安全范围；（2）适当的药动学性质；（3）在药材中有大量的分布。某些可以在血浆或者尿液等生物样品中检测出的中药有效成分，具有适当的药动学性质，可以用来证实中药的系统暴露水平，就可以作为该种中药的药物代谢标志物[49]，而合适的药物代谢标志物的选择对于设计和解释毒性及临床疗效，评估潜在的药物之间相互作用具有重要意义[50]。

Li等[51]通过LC-MS/MS技术对丹参总酚酸盐注射液中紫草酸B、迷迭香酸及紫草酸的药动学、组织分布、代谢、排泄的过程进行了系统分析。注射给药后丹参总酚酸盐快速而广泛地分布于组织内，而后被快速地消除和代谢。韦英杰等[28]对复方

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