扶正解毒方对荷瘤小鼠肿瘤相关巨噬细胞介导下血管重塑的调控研究

发布时间：2017-09-03 04:24

  本文关键词：扶正解毒方对荷瘤小鼠肿瘤相关巨噬细胞介导下血管重塑的调控研究

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【摘要】：研究背景：胃癌的复发和转移是一直困扰临床医生和限制临床疗效提高的重要难题。近年来研究表明,肿瘤免疫抑制微环境是肿瘤细胞赖以生存的基础,对促进肿瘤生长、逃避免疫监视、形成微血管方面起着重要作用。已经完成的国家自然基金课题(NO.81072802)扶正解毒法对HlF-α介导的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)促微淋巴管生成的调控研究显示扶正解毒方可以诱导肿瘤间质中的TAM向M1型转化,逆转肿瘤组织中的乏氧环境和免疫抑制状态,抑制微淋巴管的生成,其机制与干预PI3K/AKT/mTOR通路有关,同时发现扶正解毒方对移植瘤微血管生成亦有一定的调节作用。本实验以此为基础,进一步探讨扶正解毒方对荷瘤小鼠模型肿瘤相关巨噬细胞介导下血管重塑的调控机制。研究方法：造模：建立移植性前胃癌小鼠荷瘤模型(参照国家自然基金项目NO.81072802),将实验动物随机分为对照组、中药组(扶正解毒方)、化疗组(5-Fu)、中西医结合组(结合组),分别给予相应药物干预14天。作用观察：观察扶正解毒中药对前胃癌小鼠荷瘤模型移植瘤的生长及抑制情况,用超声检测小鼠移植瘤血管分布及血流参数,采用尾静脉注射荧光染料和腹腔注射乏氧探针的方法观察肿瘤组织的血流灌注量和乏氧状况。机制探讨：用FACS法检测各组小鼠CD4+/CD8+T细胞比值、Treg细胞含量,RT-PCR检测血管生成因子VEGF、MMP-9、 COX-2、及免疫抑制因子IL-6、IL-10,趋化因子CCL-17、Arg-1分泌水平,Western blot和IHP法检测血管生成素、UPR以及核心通路mTOR相关因子表达的情况。研究结果：1.荷瘤小鼠移植瘤的瘤重及抑制率对照组瘤重最高,为1.29±0.39g,药物干预后,各治疗组瘤重降低,中药组、化疗组、结合组的瘤重分别为0.93±0.37g、0.62±0.30g、0.48±0.24g；按照抑瘤率计算公式中药组、化疗组、结合组的瘤重抑制率分别为28.20%、52.09%、62.59%。2.超声观察各组小鼠肿瘤的血管分布及血流参数检测对照组肿瘤组织血流丰富,血管密集、杂乱地分布于肿瘤周边,管径较细,缺少典型、深入瘤体中心的较大血管。中药组肿瘤组织血流丰富程度不及对照组,然而其血管集中、规则,往往有1-2个深入瘤体中心的较大血管。化疗组、结合组也有部分集中深入瘤体内部的血管,但血管普遍较少,血流信号不明显。各组小鼠瘤内血流参数PSV、EDV、RI值均为：中药组对照组化疗组结合组。各组小鼠瘤体内血管Alder分级程度亦与血流参数情况类似,中药组分级程度最高,其次分别为对照组、化疗组、结合组,差异有统计学意义。3.肿瘤组织内的血流灌注及乏氧状况肿瘤组织内的血流灌注量依次为对照组中药组化疗组结合组。其乏氧严重程度亦为对照组中药组化疗组结合组,对照组乏氧情况最严重,药物干预后,治疗组乏氧状况轻度改善。4.对肿瘤相关巨噬细胞免疫抑制微环境的影响对照组肿瘤组织CD4+/CD8+T细胞比值为1.45±0.09,处于一个较低的水平,而脾组织Treg细胞的相对含量较高(2.50±0.56),且高表达M2型巨噬细胞的特征性免疫抑制因子IL-6、IL-10和趋化因子CCL-17、Arg-1,提示肿瘤微环境处于免疫抑制状态。扶正解毒中药干预后,肿瘤微环境CD4+/CD8+T细胞比值得到一定程度的提高(1.72±0.14),联合化疗组(1.96±0.31)效果最为明显：Treg细胞含量降低,中药组、化疗组、结合组分别为1.37±0.44、1.67±0.20、1.15±0.55,免疫抑制因子表达水平也降低。5.对肿瘤相关巨噬细胞促血管生成因子表达的影响移植瘤中对照组VEGFa、MMP-9、COX-2基因的转录水平最高,经药物治疗后,各组目标基因转录水平均有降低趋势,P0.05,差异具有统计学意义,结合组降低效果最为明显。VEGFa基因表达水平为对照组化疗组中药组结合组；MMP-9、COX-2基因表达水平为对照组中药组化疗组结合组,MMP-9基因表达水平结合组与中药组、化疗组相比,降低水平明显,而COX-2为化疗组、结合组的基因表达水平明显低于对照组、中药组,差异有统计学意义。对照组移植瘤高表达Ang-1、Ang-2,经药物治疗后其蛋白表达水平均降低,差异有统计学意义。Ang-1蛋白的表达水平为对照组中药组化疗组结合组,其中结合组与中药组、化疗组相比,差异显著,有统计学意义；对照组Ang-2蛋白表达水平最高,经药物治疗后各治疗组蛋白表达水平降低,差异有统计学意义,而各治疗组之间相互比较,差异无统计学意义。6.对Rheb/mTOR/p70S6K1信号通路的调控对照组高表达PI3K、Rheb、p70S6K1蛋白,中药干预后,PI3K、Rheb表达水平降低,结合组降低最为明显,对照组与各治疗组之间,差异有统计学意义。p70S6K1蛋白中药组和结合组有降低的趋势,与对照组相比,仅结合组差异有统计学意义。对照组mTOR、AK1、TSC1蛋白的光密度值较高,药物干预后表达水平降低。与对照组相比,mTOR蛋白中药组和结合组的的光密度值降低明显；AKT蛋白结合组光密度值最低,与对照组、中药组相比,差异有统计学意义；中药组、化疗组TSC1蛋白光密度值较对照组降低,结合组最少,差异有统计学意义。7.对肿瘤微环境中非折叠蛋白反应(UPR)的调控对照组GRP-78蛋白表达水平较高,经药物干预后其表达水平降低,各治疗组与对照组相比,差异有统计学意义；化疗组GRP-78的表达水平最低,但各治疗组之间差异无统计学意义。ATF-6、IRE1α、PERK对照组的光密度值最高,药物干预后降低。ATF-6、 IRE1α蛋白结合组的光密度值最低,各治疗组与对照组相比,差异有统计学意义；PERK蛋白经中药干预后,蛋白的光密度值降低,联合化疗未见效果更为明显。研究结论：扶正解毒中药能有效抑制前胃癌荷瘤小鼠模型移植瘤的生长,减少肿瘤血管生成,同时促进肿瘤局部的血流灌注,改善肿瘤微环境的乏氧状态。其机制可能在于通过调控肿瘤相关巨噬细胞表型的转化和激活,抑制TAM介导下PI3K/AKT/TSC1/Rheb/mTOR信号通路及非折叠蛋白反应(UPR)过程,逆转肿瘤免疫抑制微环境的形成,减少微环境作用下相关促血管生成因子的表达,进而发挥调控肿瘤血管重塑的作用(如图示一)。
【关键词】：扶正解毒中药 肿瘤相关巨噬细胞 免疫抑制微环境 血管生成
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R273
【目录】：

• 中文摘要7-11
• ABSTRACT11-16
• 英文缩略语16-17
• 综述一：扶正解毒法防治胃癌的理论基础及循证依据17-22
• 1. 本虚毒聚贯穿胃癌发生发展的终始17-19
• 1.1 古代医家对胃癌病机的描述17-18
• 1.2 胃癌患者中医体质的偏颇18
• 1.3 当代名老中医对胃癌病因病机的认识18-19
• 1.4 现代医学治疗对胃癌病机的影响19
• 2. 扶正解毒思想防治胃癌的临床和基础研究19-21
• 2.1 扶正解毒法在胃癌临床实践中彰显疗效19-20
• 2.2 扶正解毒法的有效性在胃癌基础研究中得到了进一步证实20-21
• 3. 展望21-22
• 综述二：肿瘤血管生成与重塑的研究进展22-33
• 1. 肿瘤血管生成及其特点22-23
• 1.1 肿瘤血管的生成过程22
• 1.2 肿瘤血管的异常结构和功能22-23
• 2. 肿瘤血管生成与重塑的机制23-25
• 3. 抑制血管生成与血管正常化是调控肿瘤血管重塑的两个方向25-26
• 4. 结语26-27
• 参考文献27-33
• 前言33-35
• 第一部分：扶正解毒方对前胃癌荷瘤小鼠移植瘤生长与血管重塑的作用观察35-46
• 实验一：扶正解毒方对前胃癌荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用观察35-40
• 1.1 材料35-36
• 1.2 方法36-37
• 1.3 结果37-38
• 1.4 讨论38-40
• 实验二：扶正解毒方对前胃癌荷瘤小鼠移植瘤血管重塑的作用观察40-46
• 2.1 材料40
• 2.2 方法40-41
• 2.3 结果41-44
• 2.4 讨论44-46
• 第二部分 扶正解毒方对前胃癌荷瘤小鼠移植瘤血管重塑的分子机制46-73
• 实验三：扶正解毒方对肿瘤相关巨噬细胞免疫抑制微环境的影响46-55
• 3.1 材料46-47
• 3.2 方法47-51
• 3.3 结果51-53
• 3.4 讨论53-55
• 实验四：扶正解毒方对肿瘤相关巨噬细胞促血管生成因子表达的影响55-63
• 4.1 材料55-56
• 4.2 方法56-59
• 4.3 结果59-61
• 4.4 讨论61-63
• 实验五：扶正解毒方对RHEB/MTOR/P70S6K1信号通路的调控63-69
• 5.1 材料63
• 5.2 方法63-64
• 5.3 结果64-67
• 5.4 讨论67-69
• 实验六：扶正解毒方对肿瘤微环境中非折叠蛋白反应(UPR)的调控69-73
• 6.1 材料69
• 6.2 方法69
• 6.3 结果69-71
• 6.4 讨论71-73
• 实验结论73-74
• 参考文献74-78
• 致谢78-79
• 研究生简介79

【参考文献】

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本文编号：782851