土茯苓化学成分分离及抗炎活性研究

发布时间：2016-08-16 16:12

本文关键词：土茯苓化学成分分离及抗炎活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

《广州中医药大学》 2014年

土茯苓化学成分分离及抗炎活性研究

胡梦梅

【摘要】：目的：为了全面揭示土茯苓抗炎活性物质基础,寻找活性强的土茯苓化合物,对土茯苓化学成分进行深入系统研究,并对分离得到的化学成分进行抗炎活性评价,对落新妇苷进行抗炎机制研究,为合理而有效的应用土茯苓提供科学依据。方法： 1.土茯苓活性部位筛选土茯苓不同部位初步分离：将100g土茯苓用70%乙醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇味,得到的土茯苓总样上大孔树脂柱,依次予水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇梯度洗脱,大致划分土茯苓化合物极性范围而得到4个部位。土茯苓不同部位成分分析：分别以NaNO2-Al (N03)3-NaOH、Folin-ciocalteu、香草醛-高氯酸、硫酸-苯酚为显色体系,采用分光光度法对土茯苓不同部位的总黄酮、总多酚、总皂苷、总多糖含量进行初步测定。土茯苓不同部位活性评价：抗氧化活性：以抗坏血酸(VC)为阳性对照,分别采用清除DPPH、ABTS自由基法及还原力测定3个抗氧化实验方法,评价土茯苓不同部位(12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)的体外抗氧化活性。抗炎活性：Griess法检测LPS (1μg/mL)和土茯苓不同部位(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)共同作用于RAW264.7巨噬细胞24小时对其分泌NO的影响。 2.土茯苓化学成分分离及结构鉴定：将7Kg土茯苓药材用70%乙醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇味,得到的土茯苓浸膏上大孔树脂柱,依次予水、60%乙醇、95%乙醇梯度洗脱,对60%乙醇洗脱部位进行系统的化学成分研究,利用现代光谱学技术(UV, IR, ESI-MS,1H-NMR,13C-NMR, DEPT, HSQC)鉴定化合物结构。 3.土茯苓化合物抗炎活性评价： MTT法检测土茯苓化合物作用于RAW264.7巨噬细胞24小时对其生长的影响,筛选安全浓度范围。 Griess法检测LPS(1μg/mL)和土茯苓化合物(安全浓度范围内)共同作用于RAW264.7巨噬细胞24小时对其分泌NO的影响。 ELISA法检测LPS (1μg/mL)和土茯苓化合物(己鉴定结构的化合物)共同作用于RAW264.7巨噬细胞24小时对其分泌TNF-α的影响。 4.落新妇苷抗炎机制研究： MTT法检测落新妇苷(10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL)作用于RAW264.7巨噬细胞24小时对其生长的影响。 Griess法检测LPS (1μg/mL)和落新妇苷(10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)共同作用于RAW264.7巨噬细胞24小时对其分泌NO的影响。 ELISA法检测LPS(1μg/mL)和落新妇苷(10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)共同作用于RAW264.7巨噬细胞24小时对其分泌TNF-α的影响。 Real-time PCR法检测LPS(1μg/mL)和落新妇苷(10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)共同作用于RAW264.7巨噬细胞12小时对其IL-6、TNF-α和iNOS mRNA表达的影响。 Western Blot法检测LPS (1μg/mL)和落新妇苷(5μg/mL10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)共同作用于RAW264.7巨噬细胞1小时对其PP65、P-P38、P-JNK、P-ERK1/2信号通路表达的影响。结果： 1.土茯苓活性部位筛选结果：土茯苓药材提取率为16.7%,土茯苓总样(TFL-Z)经初步分离后得到4个部位：水部位8.4g (TFL-1),30%乙醇部位4.5g(TFL-2),60%乙醇部位2g(TFL-3),95%乙醇部位0.7g(TFL-4),土茯苓化学成分随着洗脱溶剂极性变化而重新分布,其中总黄酮、总酚酸、总皂苷类物质主要富集在TFL-2和TFL-3部位(P0.01),多糖类物质富集在TFL-1部位(P0.01)。土茯苓总样及4个部位均具有不同的清除DPPH, ABTS自由基能力及还原能力,各部位抗氧化能力差异明显。其中TFL-2和TFL-3清除自由基能力及还原能力均显著强于TFL-Z(P0.01),且TFL-2和TFL-3清除ABTS自由基的能力显著强于VC(P0.01)。土茯苓总样及4个部位在低、中、高浓度(25、50、100μg/mL)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞释放NO均表现显著的抑制作用(P0.01),当浓度大于50μg/mL时,作用显著强于地塞米松(P0.01), TFL-Z、TFL-1、TFL-2、TFL-3、TFL-4印制NO释放的IC50分别为：92.62μg/mL、81.56μg/mL、58.53μg/mL、65.71μg/mL、51.34μg/mL。 2.从土茯苓中分离得到21个化合物,鉴定了其中9个化合物：化合物1为丁香脂素,化合物2为lasiodiplodin,化合物10为丁香酸(syringic acid),化合物12为1,4-二(3,4,5-三甲氧基)-2,3-二羟甲基-1,4-丁二醇(1,4-bis(3,4,5-trimethoxyphenyl)-2,3-bis(hydroxymethyl)-1,4-butanediol),化合物14为(-)-lyoniresinol,化合物15为咖啡酸甲酯(caffeic acid methyl ester),化合物21为反-白藜芦醇(trans-resveratrol),化合物2、5、8是首次从土茯苓中分离得到。 3.土茯苓化合物作用RAW264.7巨噬细胞24h,细胞生长存活率≥90%的安全浓度范围分别为：化合物5、11、16浓度≤200μg/mL,化合物4、7、9、14、17、20浓度≤100μg/mL,化合物2浓度≤50μg/mL,化合物3、6、8、13、18浓度≤25μg/mL,化合物1浓度≤10μg/mL,化合物10、15、19、21浓度≤1μg/mL。在安全浓度范围内化合物1、2、5、8、9、10、11、12、14、15、16、21均能不同程度抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞释放NO(P0.05),化合物1、14能显著抑制NO和TNF-α的分泌。 4.落新妇苷能与LPS协同作用激活NF-κB和MAPK信号通路,使细胞内磷酸化P65、P38、JNK、ERK1/2蛋白表达上调,同时能抑制iNOS、TNF-α mRNA炎症基因表达,抑制炎症因子NO的分泌(P0.01)。结论： 1.土茯苓乙醇提取物具有良好的抗氧化及抗炎活性,其中30%和60%的乙醇洗脱部位是土茯苓主要的活性部位。 2.土茯苓分离纯化得到21个化合物,鉴定了9个化合物结构,其中化合物2(lasiodiplodin)、5、8是首次从土茯苓中分离得到。 3.土茯苓化合物1、2、5、8、9、10、11、12、14、15、16、21能抑制RAW264.7巨噬细胞分泌NO,化合物1(丁香脂素)和14((-)-lyoniresinol)能同时抑制RAW264.7巨噬细胞分泌NO和TNF-a,具有良好的抗炎活性。 3.落新妇苷抑制iNOS和TNF-α mRNA炎症基因表达,抑制炎症因子NO的分泌,从而抑制巨噬细胞过度炎症反应,具有抗炎作用。 4.落新妇苷和LPS协同作用活化NF-κB和MAPK信号通路,增强巨噬细胞的免疫功能,提示落新妇苷可能具有免疫调节功能。

【关键词】：
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R284.1;R285
【目录】：

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