甲基苯丙胺诱导小胶质细胞活化的内质网应激机制研究

发布时间：2018-02-25 21:45

本文关键词： METH 内质网应激小胶质细胞炎症 NF- κB　出处：《河北医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:毒品滥用作为一个世界性的问题已引起国内外学者的高度关注,长期滥用不仅威胁个人身心健康,而且对家庭和社会也具有严重危害。甲基苯丙胺(methamphetamine,METH),俗称“冰毒”,属于一种苯丙胺类精神兴奋剂(ATS),是全球滥用最为广泛的毒品之一。METH在人体内极易通过血-脑屏障进入大脑中枢神经系统,并迅速刺激中枢神经系统使之兴奋性提高,长期滥用可导致成瘾、认知功能损伤、神经元不可逆凋亡等神经损害。炎症反应是长期滥用METH引起神经损伤的主要机制之一,而小胶质细胞的激活是各种刺激因素所致炎症反应的关键会聚点,活化的小胶质细胞释放大量的炎性因子和细胞毒性物质,加重多巴胺神经元的损伤甚至死亡。但是,目前关于METH诱导小胶质细胞活化的机制尚未完全阐明。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是内环境的改变导致内质网腔中大量积聚未折叠或错误折叠蛋白。它能激活未折叠蛋白反应(UPR)以恢复内质网稳态,但持久且剧烈的内质网应激可诱导细胞损伤。大量研究表明,ERS信号通路的激活与炎症反应的发生发展密切相关。然而,ERS是否参与METH诱导的炎症反应,以及ERS在此过程中发挥着什么样的作用仍不清楚。基于以上研究背景,本实验将研究内质网应激是否在甲基苯丙胺诱导小胶质细胞活化中发挥了作用,以及介导炎性因子释放的信号通路,为METH成瘾及神经损伤的治疗提供新思路。方法:1应用Western blot、Real-Time PCR(RT-PCR)方法观察1 mM METH分别作用5 min、15 min、30 min、60 min和90 min对N9细胞GRP78蛋白及m RNA表达的影响。2应用Western blot、RT-PCR法观察内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA,6 mM预处理60 min)与1 mM METH共同作用30 min对N9细胞GRP78蛋白及m RNA水平表达的影响。3给予6 mM 4-PBA预处理60 min后,应用Western blot方法检测1mM METH与6 mM 4-PBA共同作用N9细胞30 min后phospho-NF-κB p65、NF-κB p65的表达变化;分别应用流式细胞术和RT-PCR方法观察1mM METH与6 mM 4-PBA共同作用N9细胞3 h后细胞Iba1、IL-6和TNF-α的表达变化。4应用Western blot方法检测1 mM METH分别作用5 min、15 min、30 min、60 min和90 min对N9细胞IRE1α、p-IRE1α、TRAF2、PERK、p-PERK、ATF6表达的影响,以筛选参与炎症反应的信号机制。5应用免疫共沉淀法观察1 mM METH与IRE1α抑制剂STF-083010(40μM)共同作用N9细胞30 min后p-IRE1α与TRAF2的相互作用;应用Western blot检测phospho-NF-κB p65的表达;应用RT-PCR方法观察共同作用3 h后IL-6和TNF-α的表达变化。6通过转染小干扰RNA敲低N9细胞IRE1α后,应用Western blot检测1 mM METH作用30 min后p-IRE1α、TRAF2、phospho-NF-κB p65表达变化;应用RT-PCR检测1 mM METH作用3 h后IL-6和TNF-α的表达变化。7以上数据用均数±标准误(Means±S.E.M)表示,用SPSS21.0软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),以最小显著差法(Student-Newman-Keuls,SNK)作两两比较,以P0.05为差异有统计学意义。结果:1内质网应激在METH引起N9细胞活化中的作用:(1)与正常对照组相比,1 mM METH处理N9细胞30 min时,引起GRP78蛋白及m RNA水平表达显著增加,给予4-PBA后,部分逆转上述作用,提示METH诱导内质网应激的发生;(2)1 mM METH作用N9细胞引起Iba1、phospho-NF-κB p65、IL-6和TNF-α表达增加,给予4-PBA后,部分逆转上述作用,提示METH可通过内质网应激诱导小胶质细胞活化和炎性因子IL-6和TNF-α的释放。2 METH引起N9细胞活化的内质网应激相关信号通路的研究:(1)1mM METH作用N9细胞5 min、15 min、30 min、60 min和90 min后内质网应激相关信号通路IRE1α/TRAF2、PERK和ATF6均被激活,其中IRE1α/TRAF2变化最显著,因此选择此条通路进行后续研究;(2)免疫共沉淀结果显示METH增加IRE1α和TRAF2的相互作用,给予IRE1α抑制剂STF-083010后二者相互作用减弱;(3)给予IRE1α抑制剂后,部分逆转METH引起的N9细胞phospho-NF-κB p65、IL-6的表达增加,但对TNF-α无明显作用;(4)小干扰RNA敲低IRE1α后可部分逆转METH引起的p-IRE1α、TRAF2、phospho-NF-κB p65、IL-6和TNF-α的表达增加,提示IRE1α/TRAF2信号通路介导了METH所诱导的小胶质细胞的活化。结论:1 METH可诱导小胶质细胞发生内质网应激。2 METH可通过内质网应激介导小胶质细胞的活化与炎性因子IL-6和TNF-α的释放。3 METH所诱导的小胶质细胞的活化与激发IRE1α/NF-κB信号通路有关。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：D919.4

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