DYZ1阵列区分男性同卵双生子的初步探索

发布时间：2019-01-22 20:47

【摘要】：目的:同卵双生个体(monozygotic twin,MZT)甄别一直是法医遗传学领域的难题。MZT涉及的亲子鉴定和犯罪案件屡有发生,如2009年德国柏林特大珠宝盗窃案,2011年英国伯克斯郡雷丁市17岁女孩性侵案以及2013年法国马赛6个月发生的6起性侵案等。这些案件应用常规的法医个体识别系统均无法区分MZT个体,因此,寻找有效甄别MZT的遗传标记迫在眉睫。近几年来,利用DNA甲基化等表观遗传学标记区分MZT的研究众多,绝大多数均基于表型不一致的MZT病例,结果发现DNA甲基化具有组织差异性且极不稳定,因此,甄别MZT个体仍需要从基因序列上挖掘信息。随着新一代测序技术的迅猛发展,已有文献称,在多对MZT全基因组中发现二者拷贝数变异(copy number variation,CNV)或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)差异或基因的插入/缺失多态性(insertion-deletion polymorphism,InDel)差异等,这些发现均为基因组序列差异区分MZT个体提供了有利的理论依据。2014年,有文献报道,DYZ1阵列在3对MZT间存在诸多SNPs和InDels。DYZ1阵列是位于Y染色体异染色质区,以TTCCA为核心高度重复但不参与交叉互换的卫星序列,能够忠实记录个体出生后发生的变异,并在父子间代代相传。提示我们,DYZ1阵列可能是区分MZT的有效且可行的遗传标记。本研究拟应用分段扩增、克隆测序技术,联合应用实时荧光定量PCR(real-time PCR,q PCR)技术,检测41对不同年龄男性MZT个体的DYZ1阵列及其拷贝数目,建立高度重复序列长片段测序方法,寻找DYZ1阵列在MZT个体间差异,为区分MZT提供一个有潜力的遗传标记。方法:1样本采集及DNA定量:实验检材来自于本课题组2012年国家自然基金项目中建立的双生子样本库,此次采样符合伦理委员会规定且每位样本供体知情同意。样本库包含采自云南墨江、河北和山东的双生子样本195对,其中MZT135对;样本类型包括静脉血、漱口水和口腔拭子。从135对中挑选了41对男性MZT血液来源DNA(-80℃保存)应用NanoQ核酸检测仪进行定量,质量纯度范围为1.8~2.0,浓度不等。2检测拷贝数目:应用abi7500荧光定量检测仪对样本进行绝对定量。采用gotaqqpcrmastermix(promega,usa)建立荧光定量扩增体系,设置空白对照和女性样品对照确保实验数据可靠。实验首先用dyz1质粒建立标准曲线,即以2×108copies为初始值10倍梯度稀释四次。为避免实验误差,采取三复孔策略,数据取用平均值。检测后用excel和spss21.0进行wilcoxon法统计。3分段扩增、克隆测序dyz1阵列:dyz1全长3564bp,将其分为四段,长度均大约为1kb,按照标准体系进行longtaq酶长片段扩增,经过琼脂糖凝胶片段验证和回收纯化,用于后续构建质粒。按照clonejetpcrcloning(thermo,usa)试剂盒说明书将目的片段插入载体完成质粒构建。将质粒立即转化至dh5α感受态细胞,37℃恒温过夜培养,摇床转速150rpm/min。挑取培养后的单个饱满的菌落进行pcr验证和bglⅡ酶切验证。最后将阳性克隆扩大培养于3~5mllb培养基,应用常规质粒小提试剂盒回收质粒dna。将样本dna与标准品经过相同条件下的循环扩增,产物经由酒精/edta纯化法去除过量的荧光集团和反应内容,最后在10?lhi-di甲酰胺中上机测序。经过质控(qv20)的测序结果参照x06228保留有效序列,应用blast将每个个体的四个片段拼接成完整的dyz1阵列,在进行mzt两个体序列比对,从中标记差异位点。结果:1dyz1拷贝数目变异分析1.1实验有效性和特异性分析用无核酶水及女性dna样本作阴性对照,二者溶解曲线均在约72℃(样本融解温度约77℃)呈现单一低峰,说明实验中不存在气溶胶污染,体系污染以及非y染色体上的序列干扰,证明了实验引物具有目标序列特异性。五次绝对定量实验,扩增效率在95.69%~100.43%之间,r2均大于0.98,斜率均在-3.3上下浮动,融解曲线呈现高耸单峰。这证明了该部分实验的数据有效且可靠。1.240对mztcnv结果分析实验共计检测了40对mzt样本(no.1~40),除去no.40mzt外,所有样本拷贝数目主要集中在2000~5500copies,最大值为9282copies,最小值为1142copies,平均值为5190.27±162.14copies。计算mzt个体间cnv差值,用d值表示。dmax为4241copies,dmin为13copies,其中22对同卵双生子之间的d值大于1000copies,19对(no.21~39)的d值具有统计学意义(p0.05),占总样本量的48%。no.40mzt中的一个个体dyz1拷贝数结果15382.09±381.04copies,远远偏离整体均值,另一个体为5125.00±818.98copies,二者差值具有统计学意义。综上,在所检测的40对男性mzt中,20对mzt的dyz1拷贝数目存在明显差异,20对无明显差异。2dyz1阵列序列差异分析2.1总体测序结果成功获得40对mzt单克隆测序结果并完成dyz1阵列全长拼接。测序结果表明40对mzt的dyz1全长在3504bp~3589bp范围内。比较每对mzt之间dyz1阵列的匹配度发现,匹配度分布在95%~99%,95%、96%、97%、98%、99%的样本数分别为1对、5对、16对、16对和2对。2.240对mzt之间dyz1序列差异类型分析除no.17外,其余样本对间均存在长度差异,从1bp~59bp不等。40对mzt的dyz1阵列序列比对后均存在多种类型差异且差异程度不同。40对被检样本均存在序列差异。我们将序列变异分为四种类型:单碱基变异(singlenucleotidepolymorphism,snp),即双生子a与b的序列在一个对应位置上碱基类型不一致;两个及两个以上碱基变异(multiplenucleotidevariants,mnv),即二者在对应位置上连续两个或多个碱基类型不同;单碱基插入缺失(singlenucleotideindel,snindel),即双生子a与b的序列在对应位置上出现单个碱基插入或缺失的现象;以及两个及两个以上碱基插入缺失(multiplenucleotideindel,mnindel),表现同一位置插入或缺失两个或多个连续碱基。测序结果整体上,发生碱基变异位置多于发生插入缺失的数量,所有样本中累计长度变异总数为848bp,而累计序列变异总数为2067bp。所有mzt之间均存在诸多snp,累计达到1882bp,一对mzt间发生snp最少者有31处,最多者高达67处。35对mzt间发现mnp,主要以2个连续碱基变异为主,发生3bp、4bp变异各1次和4次。mzt间的snindel发生次数远远少于snp,所有样本累计187bp,几乎每对mzt均小于10处,仅no.27、no.8发生较多,分别为23处和21处,但仍小于每对MZT间SNP发生最少的No.2,为31处。MNInDel发生以2bp、3bp、4bp碱基插入缺失为主,MZT间总长度差异较大者均至少发生一次15bp或15bp以上的片段插入丢失。2.3测序准确性验证为验证测序结果的准确性,随机挑选了10个克隆DNA重复测序,在测序平台的有效读长范围(51bp~750bp)内,同一样本两次测序结果完全一致,即单克隆测序结果准确性为100%。结论:本研究采用分段扩增、克隆及Sanger测序对DYZ1阵列进行测序拼接,发现40对男性MZT之间DYZ1序列均存在序列差异,包括碱基变异及插入缺失,其中20对MZT间还存在拷贝数变异,提示DYZ1阵列可作为甄别男性MZT的候选标记,值得进一步深入研究。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：D919.4

【参考文献】