PCR法检测硅藻SSU基因在溺死鉴定中的应用

发布时间：2017-10-01 13:18

  本文关键词：PCR法检测硅藻SSU基因在溺死鉴定中的应用

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【摘要】：目的：溺死(drowning)是机械性死亡的一种。我国河道水网密集,水中尸体多发,在江河湖海中发现的尸体可能属于意外溺水死亡,但也可能为自杀或他杀,也不排除死后抛尸入水伪造意外溺水身亡,因此水中尸体可能与刑事案件相关,必须进行法医学鉴定。溺死的鉴定及对其实用性、科学性的评价是法医学领域长期以来的重要课题之一。确定生前入水和死后入水是解决溺死类案件的关键,由于其他生物学和尸体化学的溺死检验指标尚未得到科学的确认,因此,硅藻检验仍是目前鉴定溺死的“金标准”。近年来,对溺死的相关报道主要集中于不同水域溺死案件的鉴定或回顾性研究,且主要着重于尸体脏器中硅藻的检出及检出率比较,对传统硅藻提取、检测方法的改良及优缺点比较,而忽略脏器内硅藻种类与溺死地点硅藻种类的比较及新的、灵敏度高、特异性强的硅藻检验方法的探索。本研究主要通过酶消化法分离硅藻,在保证操作者安全的同时,减少硅藻的破坏和损失；硅藻DNA的提取使用MoBio强力土壤DNA提取试剂盒(PowerSoilTM DNA Isolation Kit),能高效提取硅藻基因组DNA,且DNA纯度高,可直接用于下游实验；选用硅藻特异性引物,通过PCR法扩增硅藻SSU基因,通过琼脂糖凝胶电泳及PCR产物测序,验证引物特异性。DHPLC法不仅可以对PCR产物的片段大小进行分析,还能对PCR产物的构象及碱基组成比例进行检测分析,因此本研究采用DHPLC法(高效变性液相色谱法)对溺死人体脏器及溺死地点水样中的硅藻进行分析,区分不同水域硅藻种属,为判断溺死人体脏器内硅藻种属与溺死地点硅藻种属是否相同提供依据,具有灵敏度高、特异性强的优点。此外,本研究中还应用了毛细管电泳检测硅藻SSU基因,此法也具有灵敏度高、特异性强的优点,毛细管电泳法因其应用广泛、操作简单,因此在溺死鉴定和溺死地点推断中易普及推广,为硅藻检验提供了一种新方法、新思路。 方法：把实验动物60只随机分成3组,分别为生前溺死(水中溺毙)、死后入水(空气栓塞致死后入水)、对照组(空气栓塞致死后不做处理),每组20只；从广州市刑事科学技术研究所获取溺死诊断阳性人体脏器组织30份,包括肺、肝、肾组织,提取各组织检材硅藻DNA,PCR扩增硅藻特异的核糖体小亚基(SSU)片段,用琼脂糖凝胶电泳检测、PCR-DHPLC检测、PCR-CE检测分析,评估PCR-DHPLC法和PCR-CE检测硅藻SSU基因在溺死鉴定中的应用价值。 结果：在动物实验中,生前溺死组肺、肝、肾硅藻检出率分别为100%、90%、85%,死后入水组仅肺检出硅藻(15%),对照组各组织均为阴性；生前溺死组检出率明显高于死后入水组(P0.05)。通过PCR-CE法对20只溺死实验动物的肝、肾、肺进行检验,结果发现随着检材量的增加,检出的硅藻种类数增加,且均存在正相关；肺内检出硅藻种类与检材量的相关系数是0.433(P0.01),肝内检出硅藻种类与检材量的相关系数是0.623(P0.01),肾内检出硅藻种类与检材量的相关系数是0.613(P0.01)。当检材量大于0.9g时,肺内检出硅藻种类以2种及2种以上为主；当检材量大于1.5g时,肝内检出硅藻种类以1种及1种以上为主；当检材量大于2g时,肾内检出硅藻种类以1种及1种以上为主。20例溺死诊断阳性的人体器官组织检材用PCR-CE法检出硅藻种类明显多于微波消解-扫描电镜法(P0.05)。10例溺死诊断阳性的人体器官组织检材用DHPLC法检出硅藻种类明显多于微波消解-扫描电镜法(P0.05)。 结论：PCR-DHPLC法是一种新的诊断溺死的方法,此法具有灵敏度高、特异性强的优势；PCR-DHPLC法可对不同硅藻种属进行分离和鉴定,不仅准确性高、可信度强,还能为判断溺死人体脏器内硅藻种属与溺死地点硅藻种属是否相同提供依据,从而为溺死鉴定和溺死地点推断提供较好的方法和平台。通过PCR-CE法检测硅藻SSU基因,具有很强的灵敏度和特异性,且具有较好的普及性和推广性,为法医学硅藻检验提供了一条新思路。
【关键词】：法医病理学 溺死 硅藻检验 SSU PCR DHPLC CE
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：D919
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 引言12-20
• 1.1 溺死及溺死鉴定的意义12-13
• 1.2 硅藻提取及检测方法的分类及发展13-15
• 1.3 硅藻检验的现状及发展趋势15-17
• 1.4 硅藻DNA检验的优势17-18
• 1.5 立项依据及研究思路18-20
• 第二章 PCR-Agarose电泳检测硅藻SSU基因方法建立20-29
• 2.1 材料20-22
• 2.1.1 主要仪器20-21
• 2.1.2 主要试剂及耗材21-22
• 2.1.3 实验动物分组22
• 2.1.4 模型制作22
• 2.1.5 样本来源22
• 2.2 方法22-26
• 2.2.1 组织中硅藻分离方法22-23
• 2.2.2 水样硅藻分离方法23
• 2.2.3 硅藻DNA提取23-24
• 2.2.4 硅藻DNA纯度检测24-25
• 2.2.5 PCR扩增25
• 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳25-26
• 2.2.7 PCR产物测序26
• 2.3 结果26-27
• 2.3.1 硅藻DNA纯度26
• 2.3.2 硅藻及其对照样本扩增产物电泳结果26-27
• 2.3.3 PCR产物测序结果27
• 2.3.4 实验动物器官检出率结果27
• 2.4 讨论27-29
• 第三章 PCR-CE法检测硅藻SSU基因29-40
• 3.1 材料30-31
• 3.1.1 主要仪器30
• 3.1.2 主要试剂及耗材30-31
• 3.1.3 样本来源31
• 3.2 方法31-34
• 3.2.1 组织中硅藻分离方法31
• 3.2.2 水样硅藻分离方法31
• 3.2.3 硅藻DNA提取31-33
• 3.2.4 PCR扩增33
• 3.2.5 毛细管电泳33-34
• 3.2.6 微波消解-扫描电镜法检验硅藻34
• 3.3 结果34-39
• 3.4 讨论39-40
• 第四章 PCR-DHPLC法检测硅藻SSU基因40-51
• 4.1 材料42-43
• 4.1.1 主要仪器42
• 4.1.2 主要试剂及耗材42-43
• 4.1.3 样本来源43
• 4.2 方法43-47
• 4.2.1 组织中硅藻分离方法43
• 4.2.2 水样硅藻分离方法43
• 4.2.3 硅藻DNA提取43-45
• 4.2.4 PCR扩增45
• 4.2.5 DHPLC温度预测45
• 4.2.6 配制DHPLC缓冲液45
• 4.2.7 DHPLC仪操作流程45-46
• 4.2.8 DHPLC异常峰型分析46-47
• 4.2.9 微波消解-扫描电镜法检验硅藻47
• 4.3 结果47-49
• 4.3.1 DHPLC结果47-48
• 4.3.2 DHPLC法与微波消解-扫描电镜法硅藻检出结果比较48-49
• 4.4 讨论49-51
• 全文小结51
• 存在的问题和展望51-53
• 参考文献53-58
• 附录58-68
• 研究生期间研究成果68-69
• 致谢69-70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

1 陈东才;魏祯祥;宋绳绪;林锬;陈福林;陈若壁;曹水金;刘塘钱;刘奇馨;林金树;;硅藻在活体脏器内能否长期存积的实验研究[J];中国法医学杂志;1986年02期

2 王磊;王恩寿;黄映康;;硅藻定量检验和种属鉴定的实验研究[J];中国法医学杂志;1992年04期

3 王磊,王杰,王恩寿,黄映康;非溺死尸体肺脏硅藻最大值在溺死鉴定中的应用初探[J];中国法医学杂志;1998年03期

4 何方刚;黄代新;刘良;闫平;孟祥志;张勇;;PCR-DGGE法检测浮游生物16S rDNA在溺死鉴定中的应用[J];中国法医学杂志;2008年04期

5 胡孙林;温锦锋;张小婷;方超;王松才;戴维列;刘超;;微波消解-扫描电镜联用检测脏器内硅藻[J];中国法医学杂志;2010年03期

6 陈福林;;硝酸乙醚破机法检测硅藻的研究[J];法医学杂志;1990年02期

7 孙维琦,于晓军,李坦;微波消解法检验硅藻的实验研究[J];法医学杂志;2002年03期

8 汪家文;于晓军;王晓雁;;溺死法医学鉴定的研究新进展[J];法医学杂志;2008年04期

9 王磊,王杰,黄映康;生前硅藻空气源性吸入肺最大值在溺死鉴定中的应用[J];贵阳医学院学报;2005年04期

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本文编号：953663