Cry1Ah蛋白杀虫特异性分子机制的研究

发布时间：2018-05-04 21:54

  本文选题：Cry1Ah蛋白 + 杀虫特异性　； 参考：《中国农业科学院》2013年博士论文

【摘要】：苏云金芽胞杆菌因其对多种害虫具有杀虫活性，不污染环境，对人畜无害，因而在害虫的生物防治中得到了广泛的应用。cry1Ah1基因是本实验室分离克隆的具有自主知识产权的杀虫基因，由于其编码的Cry1Ah蛋白对多种鳞翅目害虫具有较高的杀虫活性，目前cry1Ah1基因被应用于转基因玉米和水稻的研究中。 为了评价cry1Ah1基因对非靶标昆虫的安全性，本文首先对Cry1Ah蛋白对鳞翅目中重要的经济昆虫家蚕（Bombyxmori）进行了活性测定，结果表明：Cry1Ah蛋白对家蚕的致死中浓度（LC50）大于500μg/mL。这不仅明确了对棉铃虫（Helicoverpaarmigera）等害虫高毒力的Cry1Ah蛋白（LC50=7.04μg/g）对非靶标昆虫（家蚕）是安全低毒（LC50500μg/mL），更重要的是为cry1Ah1基因的推广及应用提供了理论依据。 Cry1Ah的这种特性恰恰与本实验室分离克隆的另一个拥有自主知识产权杀虫基因cry1Ai相反，Cry1Ai蛋白对家蚕表现出很高的毒力（LC50=5.25μg/mL），但对棉铃虫则表现出较低的活性（LC50500μg/g），而两者的氨基酸相似性为84%，并且拥有相似的三维结构。基于这种发现，本研究旨在揭示Cry1Ah蛋白对棉铃虫等农业害虫高毒力、对经济昆虫家蚕相对安全低毒的分子机制。 本文以Cry1Ah蛋白为研究重点，以Cry1Ai蛋白为对照材料，一方面通过构建定点突变体、截短片段以及Loop突变体，明确Cry1Ah蛋白杀虫活性相关位点、Cry1Ai蛋白的杀虫活性区域，以及两者与杀虫特异性相关的Loop区域。另一方面，利用配体垂钓平台分别分析Cry1Ah蛋白和Cry1Ai蛋白在棉铃虫和家蚕刷状缘膜微囊泡（BrushBorderMembraneVesicles，简称BBMVs）上的特异性结合蛋白。主要研究结果如下： （1）利用定点突变的方法构建了Cry1Ah蛋白DomainⅠ和DomainⅡ上7个突变体，对比Cry1Ah蛋白对棉铃虫的生物活性发现，Cry1Ah蛋白DomainⅠ中α-6螺旋上第206位氨基酸突变为丙氨酸时，其对棉铃虫的杀虫活性略有降低，而在DomainⅡ上Loop3的第463位添加多个天冬酰胺时，能够降低其对棉铃虫的杀虫活性。 （2）构建了26个Cry1Ai蛋白的截短片段，通过对小菜蛾的生物活性测定，将Cry1Ai蛋白对小菜蛾（Plutellaxylostella）的最小活性区域精准定位为第36I到605I氨基酸残基。 （3）通过分析比较Cry1Ah/Cry1Ai毒素在棉铃虫和家蚕中肠BBMVs上的结合蛋白，探寻结合蛋白与杀虫特异性的关系。研究发现，Cry1Ah蛋白与棉铃虫BBMVs上的氨肽酶N（AminopeptidaseN，简称APN）能够特异的结合，而在家蚕的BBMVs上没有检测到这种高亲和力的结合，这可能是Cry1Ah蛋白对棉铃虫杀虫特异性的原因。而Cry1Ai蛋白在家蚕的BBMVs上也存在一些特异的结合蛋白，但这些结合蛋白仍需进一步验证。 （4）为了进一步确定Cry1Ah蛋白与棉铃虫APN特异性结合的原因，本研究分析比较Cry1Ah蛋白和Cry1Ai蛋白的氨基酸序列和三维结构，研究发现，两者在受体结合区域的主要差别在DomainⅡ的Loop2和Loop3上，通过构建Loop互换突变体，以及比较突变体的生物活性，发现Cry1Ah和Cry1Ai蛋白Loop2的互换使得Cry1Ai蛋白获得了对棉铃虫的杀虫活性（Cry1Ai-hloop2：LC50=64.23μg/g），而Cry1Ah蛋白则失去了对棉铃虫的杀虫活性（Cry1Ah-iloop2：LC50500μg/g）；但Loop2的互换并没有改变两种蛋白对家蚕原有活性（Cry1Ai-hloop2：LC50=11.60μg/mL；Cry1Ah-iloop2：LC50500μg/mL），这说明DomainⅡ的Loop2与棉铃虫杀虫特异性密切相关。而两个蛋白Loop3互换时，不但没有使Cry1Ai蛋白没有获得对棉铃虫的杀虫活性（Cry1Ai-hloop3：LC50500μg/g），反而导致Cry1Ah蛋白失去了对棉铃虫的杀虫活性（Cry1Ah-iloop3：LC50500μg/g），这说明Loop3对Cry1Ah和Cry1Ai蛋白保持原有的对棉铃虫的杀虫活性比较重要。 Cry1Ah蛋白对非靶标昆虫（家蚕）安全性的明确，，将有利于cry1Ah1基因的推广应用，同时也为新型cry基因的发掘和应用提供筛选和评价标准；Cry1Ah蛋白杀虫特异性相关受体的确定，以及Cry1Ah蛋白上与杀虫特异性相关氨基酸区域的明确，初步揭示了Cry1Ah蛋白对棉铃虫杀虫特异性的分子机制，为cry1Ah1基因的推广应用奠定了坚实的理论基础，同时也为其它Cry蛋白的定向改造提供重要借鉴。
[Abstract]:The Bacillus thuringiensis has the insecticidal activity to many kinds of pests, does not pollute the environment and is harmless to the human and animal. Therefore, the.Cry1Ah1 gene has been widely used in the biological control of the pests. It has the independent intellectual property of the insecticidal gene, which is isolated and cloned in our laboratory. Because of its coding Cry1Ah protein, it has a better effect on a variety of Lepidoptera pests. High insecticidal activity, the cry1Ah1 gene has been applied to the research of transgenic maize and rice.
In order to evaluate the safety of cry1Ah1 gene for non target insects, the activity of Cry1Ah protein to the important economic insect (Bombyxmori) in Lepidoptera (Bombyxmori) was measured. The results showed that the lethal concentration of Cry1Ah protein (LC50) was greater than 500 mu g/mL., which was not only clear to the high insect pests of cotton bollworm (Helicoverpaarmigera) and so on. The toxic Cry1Ah protein (LC50=7.04 g/g) is a safe and low toxicity (LC50500 mu g/mL) to the non target insect (silkworm), and more importantly, it provides a theoretical basis for the promotion and application of cry1Ah1 gene.
This characteristic of Cry1Ah is the opposite of another independent intellectual property killing gene cry1Ai, which is cloned in our laboratory. Cry1Ai protein shows a high toxicity (LC50=5.25 mu g/mL) to silkworm, but it shows a lower activity (LC50500 mu g/g) to the cotton bollworm (LC50500 mu g/g), and the two amino acid similarity is 84%, and it has a similar three dimension. Structure. Based on this discovery, this study aims to reveal the high toxicity of Cry1Ah protein to cotton bollworm and other agricultural pests, and the molecular mechanism of relatively safe and low toxicity to the Bombyx mori.
In this paper, we focus on Cry1Ah protein and use Cry1Ai protein as the control material. On the one hand, by constructing the fixed-point mutants, truncated fragments and Loop mutants, the insecticidal activity related sites of Cry1Ah protein, the insecticidal activity region of Cry1Ai protein and the Loop region related to the specificity of the insecticides are also identified. On the other hand, the ligands are angled by the ligands. The specific binding proteins of Cry1Ah protein and Cry1Ai protein in the BrushBorderMembraneVesicles (BBMVs) of cotton bollworm and Bombyx mori were analyzed respectively. The main results were as follows:
(1) 7 mutants on Cry1Ah protein Domain I and Domain II were constructed by site directed mutagenesis, and the bioactivity of Cry1Ah protein to Helicoverpa armigera was compared. When Cry1Ah protein Domain I mutated to alanine with 206th amino acids on the alpha -6 spiral, the insecticidal activity of Cry1Ah protein to Helicoverpa armigera was slightly reduced, and 463rd bits of Loop3 in Domain II were added. Adding asparagine can reduce its insecticidal activity against Helicoverpa armigera.
(2) the truncated fragments of 26 Cry1Ai proteins were constructed. By measuring the bioactivity of the diamondback moth, the Cry1Ai protein was accurately positioned as the 36I to 605I amino acid residues in the smallest active region of the Plutella xylostella (Plutellaxylostella).
(3) through the analysis and comparison of the binding proteins of Cry1Ah/Cry1Ai toxin on BBMVs in the midgut of Helicoverpa armigera and silkworm, the relationship between binding proteins and insecticidal specificity was explored. It was found that the Cry1Ah protein and the aminopeptidase N (AminopeptidaseN, APN) on the BBMVs of cotton bollworm could be specifically bonded, but the high affinity was not detected on the BBMVs of the silkworm. The combination of forces may be the reason for the specificity of Cry1Ah protein against Helicoverpa armigera, and the Cry1Ai protein also has some specific binding proteins in the BBMVs of the silkworm, but these binding proteins still need to be further verified.
(4) in order to further determine the reason for the specific binding of Cry1Ah protein to the APN of cotton bollworm, this study compared the amino acid sequence and three-dimensional structure of Cry1Ah protein and Cry1Ai protein. It was found that the main differences in the receptor binding regions were on the Loop2 and Loop3 of Domain II, by constructing Loop exchange mutants and comparison mutants. It was found that the exchange of Cry1Ah and Cry1Ai Loop2 made the Cry1Ai protein obtain the insecticidal activity (Cry1Ai-hloop2:LC50=64.23, g/g) to cotton bollworm, while the Cry1Ah protein lost the insecticidal activity (Cry1Ah-iloop2:LC50500 u g/g) to the cotton bollworm (Cry1Ah-iloop2:LC50500 u g/g), but the exchange of Loop2 did not change the original activity of the two proteins to the silkworm (C). Ry1Ai-hloop2:LC50=11.60 mu g/mL; Cry1Ah-iloop2:LC50500 mu g/mL), which indicates that Loop2 of Domain II is closely related to the specificity of insecticidal specificity of Helicoverpa armigera. While the two protein Loop3 exchange, not only does not make Cry1Ai protein do not obtain the insecticidal activity (Cry1Ai-hloop3:LC50500 mu g/g) to cotton bollworm (Cry1Ai-hloop3:LC50500 micron g/g), but the Cry1Ah protein is lost to the cotton. The insecticidal activity of Bollworm (Cry1Ah-iloop3:LC50500 g/g) indicates that Loop3 is more important for Cry1Ah and Cry1Ai proteins to maintain their original insecticidal activity against Helicoverpa armigera.
The definite safety of Cry1Ah protein to non target insect (silkworm) will be beneficial to the promotion and application of cry1Ah1 gene. It also provides screening and evaluation criteria for the discovery and application of new cry genes, the determination of Cry1Ah protein specific receptor related to insecticides, and the clear region of the specific amino acid related to the insecticidal protein on the Cry1Ah protein. The molecular mechanism of Cry1Ah protein to insecticidal specificity of Helicoverpa armigera was revealed, which laid a solid theoretical basis for the promotion and application of cry1Ah1 gene, and also provided an important reference for the directional transformation of other Cry proteins.

【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：S476.1

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本文编号：1844821