基于新型联吡啶钌—多环糊精衍生物的荧光生物传感技术研究与应用

发布时间：2019-03-08 11:12

【摘要】：在21世纪的科学研究中,人类对于生命物质的探索一直是生命科学研究领域中的重要内容之一,其中实现对于寡核苷酸链、蛋白、核酸适配体、腺苷等生命体组成物质的测定更是与常见疾病的诊断以及临床医药的研究息息相关。如三磷酸腺苷(ATP),不仅是生命体中重要的信号传输物质,涉及了酶活动,也是生物辅酶因子的重要构成部分,并且能够指示细胞活性与细胞损伤,它的缺失会导致诸如贫血、低血糖、帕金森等疾病；溶菌酶,是哺乳类动物的必需蛋白,它能够使细胞壁破裂让内溶物流出而溶解细菌或者直接结合带负电的病毒蛋白,导致病毒失活,具备消炎抗菌等作用,因此溶菌酶通常被称作“生命体抗生素”。这些蛋白或是小分子具备一定的通性,即它们都能够和对应的核酸适配体形成结合物,许多研究工作正是基于这个特性而展开的。金属环糊精构成的超分子化合物将具备主客体识别性质的环糊精骨架与金属核中心相连接,而金属核中心自身具备良好的光活性能、氧化还原特性以及导电性,这些特点被结合至单个分子中。通常金属环糊精识别包络了客体分子,在金属核中心与客体分子之间产生能量或者电子转移,致使检测到的光学信号发生改变,基于金属环糊精的这个特点,它在超分子体系包括传感器、分子导线等的设计中应用越来越广泛,因而吸引了众多科学工作者的关注。目前,很多研究围绕联吡啶钌作为修饰基团的荧光生物传感技术这一热点而进行深入探索,它在生物分析、临床诊断、食品检测等领域都极具研究价值,仍然有不少研究工作者或是研究机构投入大量的力量去合成联吡啶钌修饰的衍生物质,试图利用其高效的荧光发射效率、出色的光学活性与荧光检测技术联用,在保持生物分子活性的同时,实现对这些生物分子的超灵敏检测。我们课题组之前合成一系列的新型联吡啶钌——环糊精衍生物质,包括有两大类别,即多钌中心以及多环糊精中心。多联吡啶——环糊精衍生物不仅展现了良好的电致化学发光性能,而且我们考察了其对于环糊精典型的客体分子仍然具备出色的主客体识别作用。基于这些特点,构建了一系列不同类型的电致化学发光生物传感技术,去实现体系中DNA、溶菌酶、凝血酶、ATP等的超灵敏检测；在此论文中,我们利用后者：联吡啶钌——多环糊精衍生物出色的荧光特性与主客体识别特性,继续创建了核酸适配体荧光生物传感平台,期望提升其在同类型传感技术中的灵敏度,为人类生命物质的探索和重大疾病的诊断拓展新的有利思路,因而这项工作具备深远而重大的意义。本论文一共分为以下三章内容,具体如下所示。第一章绪论在这个章节中,讨论了环糊精作为超分子化学领域中常见的主体分子,它的结构特性以及优点,之后着重阐述了金属环糊精超分子化合物的优异性能所以被广泛应用到生物传感器的设计中,强调了研究的背景意义。之后,介绍了荧光生物传感器的构建原理,荧光技术作为一种最为广泛使用的检测手段之一,具备简便易测、重现性好、灵敏度高等特点,对于核酸适配体荧光生物传感技术以及环糊精修饰的荧光生物传感技术的研究进展作了详细展开。最后,根据上述研究内容的背景,对本论文的研究目的、意义和内容作了相应的概括。第二章基于联吡啶钉——多环糊精衍生物和主客体识别的溶菌酶荧光适配体传感技术的研究在本章中,利用课题组合成的新型联吡啶钌——多环糊精衍生物具有出色的荧光光学活性,基于此,我们进一步考察了其主客体识别能力。荧光光谱显示,单链DNA (ssDNA)能够显著增敏该类金属环糊精衍生物的荧光强度,这是由于ssDNA上碱基与环糊精空腔的主客体识别作用,从而导致了ssDNA与金属环糊精结合致使钌中心受到保护,有效地防止了其被溶液中的溶解氧猝灭,因而荧光信号剧烈提升。由此我们设计了一种使用荧光检测技术构建灵敏的生物传感器实现溶菌酶的测定。首先,金属环糊精衍生物的荧光强度被ssDNA(即溶菌酶-核酸适配体)提升,随后在此体系中加入溶菌酶分子,由于其与溶菌酶-核酸适配体更强的结合作用从而形成了结合物,削弱了溶菌酶-核酸适配体与金属环糊精的结合作用导致最终荧光信号的下降。利用前后荧光信号的差值可以定量检测体系中溶菌酶的含量。实验表明,荧光改变值与体系中溶菌酶浓度的对数值在5×10-7M至5×10-10M范围内,呈现了良好的线性关系,其检测限达到48 pM。该传感技术具有简便,高灵敏的特点,且无需额外标记以及放大步骤,应用前景广泛。第三章基于联吡啶钌——六环糊精衍生物和核酸适配体主客体识别检测三磷酸腺苷的荧光传感技术新型联吡啶钌——六环糊精衍生物相比于母体分子：联吡啶钌,具备更强的荧光特性,原因在于其周围连接的环糊精单元对于联吡啶钌中心有着保护作用,能够防止其被溶液中的溶解氧所猝灭。荧光光谱显示,核酸适配体能够进一步显著提升联吡啶钌——六环糊精衍生物的荧光强度,这是因为核酸适配体的组成成分：碱基和环糊精空腔存在主客体识别作用,因而促进了适配体与这种新型超分子化合物的结合,进一步对钌中心加强了保护作用。基于此,我们设计了一种高灵敏,无需额外标记的荧光核酸适配体传感技术检测体系中的三磷酸腺苷含量。首先,加入核酸适配体,联吡啶钌——六环糊精衍生物的荧光强度大大提升,随后向该混合体系中加入目标分子：三磷酸腺苷后,由于三磷酸腺苷与其核酸适配体之间存在更强的结合力,削弱了适配体和联吡啶钌——六环糊精衍生物的结合,因此荧光信号的增敏作用消失,用来定量检测三磷酸腺苷的浓度,检测限可至0.5 nM(S/N=3)。该适配体荧光传感技术具备高灵敏度和良好的选择性,且无需额外标记或放大步骤,并且适用性广泛。
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【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TP212.3;TQ422

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