一种新型基因转换系统检测基因早期突变方法的建立与验证

发布时间：2017-12-30 09:18

  本文关键词：一种新型基因转换系统检测基因早期突变方法的建立与验证　出处：《苏州大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的:建立一种偶联高保真DNA聚合酶和限制性内切酶构成的体外基因型转换系统,采用CDH1基因c.67CT突变作为测试体系,验证此基因转换系统方法的可行性。方法:首先构建含有HaeIII酶切位点的CDH1基因野生型片段模板和突变序列模板。将CDH1基因野生型基因片段与突变型基因片段按照野生比突变(W:T)=10:1,100:1,1000:1的比例混合,模拟人类早期肿瘤时血中游离核酸中突变基因较少而野生型基因片段较多的临床情形。使用高保真DNA聚合酶在有HaeIII酶存在的情况下进行PCR扩增。使野生型基因序列片段由于HaeIII酶存在而不停地在体外基因型转换的每个循环中均被限制性内切酶消化,扩增效率降低;而突变型基因序列片段由于突变位点正好位于酶切位点,不能被HaeIII酶酶切消化,从而可以被大量扩增;同时,高保真DNA聚合酶还能对限制性内切酶消化的野生片段进行校正,将其在突变点相对应的野生碱基切除,然后依据突变序列为模板进行扩增,达到了基因型转换的效果。结果:3种不同比例的野生和突变序列混合PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示,在高保真DNA聚合酶介导的PCR反应偶联限制性内切酶所构成的体外基因型转换体系中,纯野生型基因片段的PCR产物可以被HaeIII限制性内切酶酶切,而存在突变型基因片段的PCR产物的则有不能被酶切的片段产生,这是一种很好的二元化显示效果。测序结果也证实了突变型基因获得了大量扩增,其中10:1的结果完全翻转,由10:1变成了大约2:3。由此可以验证基因型转换系统是一种具有特异性和灵敏度的新的检测方法。结论:本课题在充分利用高保真DNA聚合酶及耐高温的限制性内切酶特点的基础上联合特异性引物构成一个基因转换系统,通过采用CDH1基因c.67CT单个碱基突变作为测试对象,验证了新方法的可行性。这个基因转换系统可在基因早期筛查以及肿瘤手术后的复发监控等多方面具有较大的实际应用价值。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R440

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本文编号：1354231