DNA电化学生物传感器在汞和凝血酶分析检测中的应用研究

发布时间：2018-02-08 08:52

本文关键词： 电化学DNA生物传感器金属离子凝血酶杂交链反应酶　出处：《西南大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：DNA电化学生物传感器(DNA electrochemical biosensor)是一门新兴的、涉及生物化学、电化学、医学、电子学及信息技术等领域的交叉学科；利用DNA分子间的特异性互补配对规律发展起来的各种DNA生物传感技术一种全新的生命科学研究方法,并在生命科学领域引起了广泛关注。DNA电化学生物传感器有生物分子间的特异性亲和能力和对目标物的选择性识别能力,因此实现了对目标物的高灵敏高选择性分析检测。DNA电化学生物传感器具有简单、可靠、灵敏、快速、成本低和选择性好等优点,近年来,其在分子生物学、生物医学工程、环境监测、食品卫生检验等方面显示了广阔的应用前景,已成为当今生物学、医学领域的前沿性课题。以电化学方波循环伏安、差分脉冲、循环伏安、交流阻抗等方法研究生物传感器电极表面的电活性物质的物理化学性质变化,实现对不同目标物的分析检测。本文构建了三种DNA电化学生物传感器。主要研究工作如下：1.基于核酸切刻内切酶辅助信号放大构建灵敏选择性检测Hg2+的DNA生物传感器基于亚甲蓝和核酸切刻内切酶在有无Hg2+存在时,电化学响应信号的不同,构建了一种电化学分析检测Hg2+的新方法。当Hg2+存在时,发卡形探针A的环部与错配探针B通过T-Hg2+-T错配碱基进行杂交互补,形成切刻识别位点,同时发卡形探针A的茎部打开。核酸切刻内切酶识别出识别位点、剪切杂交双链中的探针A。亚甲蓝标记的DNA序列被剪切下来,并离开电极表面。同时,释放出来的Hg2和探针B能再次被用于进行下一个循环反应,从而使更多的亚甲蓝离开电极表面,最终获得明显降低的电流信号。在理想条件下,此传感器对Hg2+的检测限为8.7×10-11mol L-1。利用此方法构建用于Hg2+检测的生物传感器具有较高的灵敏度。2.基于Hg2+诱导形成血红素-G-四链体复合物构建一种简单免标记定量检测Hg2+的电化学生物传感器利用胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(Thymine-Thymine, T-T)错配碱基能特异性识别Hg2+形成T-Hg2+T错配碱基对。当Hg2+存在时,探针S2 (5'-GGG AGGTGAAAATT GTTGGTTGTTCC-3')通过T-Hg2+-T错配碱基对与固定在金电极表面上的探针S1(5'-GGAACATCCTTCTTAAAAGGGCAGGG-(CH2)6-SH-3')部分杂交互补,部分杂交形成的双链DNA在靠近电极部分的分裂G-四分体在hemin和K+的帮助下能形成G-四链体-hemin复合物。通过电化学方法检测可获得明显的电化学电流响应。在最优条件下,该生物传感器测定得到的DPV电流信号与Hg2+浓度的对数呈现良好的线性相关性,线性范围为50 pmol L-1到100 nmol L1,检测限为35pmol L-1。该电化学生物传感器具有灵敏度高、稳定性和重现性好、制备简单且成本低的优点,并成功应用于水样中痕量汞离子的检测。3.基于凝血酶适配体和HCR信号放大技术构建一种灵敏检测凝血酶的电化学生物传感器利用凝血酶与凝血酶适配体高效特异性识别作用,当有凝血酶存在时,S2(5”-CAGACGGTCTAGTTTTTTTTTTTTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3')和与S0(5'-HS-(CH2)6-TTTTTGGCAGACGGTCTAGCTTTA-3')部分杂交的S1(5'-GGTTGGT GTGG TTGGTTTTTTTTTTTTTTTCTAGACCGTCTGCC-3')能利用他们所含的凝血酶适配体与凝血酶特异性结合形成三明治结构,此结构具有更强的稳定性,所以S1能与SO解链形成三明治结构而脱离电极表面,最终只剩单链S0在电极上。然后再加入H1(5'-AGGGCGGGTGGGTCTAGCTTTTGGAGAAGTGTAAAGCTAGACCGTCTGCCT GGGT-3')和H2(5'-TGGGTCACTTCTCCAAAAGCTAGTGGCAGACGGTCTAGCTTTTGGG TAGGGCGGG-3'), SO能有效打开发卡形H1并诱发H1与H2发生杂交链反应(HCR)反应；并使分裂的G-四分体的DNA序列相互靠近。在血红素(hemin)和K+的帮助下,形成大量的G-四链体-hemin复合物,通过电化学检测从而可以实现免标记、信号增强型、简单快速定量检测凝血酶。在最优条件下,该生物传感器测定得到的DPV电流信号与凝血酶浓度的对数呈现良好的线性相关性,线性范围为5 pmol L-1到5 nmol L-1,检测限为2.9 pmol L-1。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.1;TP212.3

【参考文献】