RGD-TAT-NLS介导的非病毒基因载体OTMCS-PEI-R18的构建

发布时间：2018-02-08 14:53

本文关键词： 非病毒基因载体聚乙烯亚胺靶向核定位信号肽细胞穿膜肽　出处：《上海海洋大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：基因治疗作为近年来兴起的新型治疗方法,针对肿瘤的发病根源,从分子水平将治疗基因导入人体靶细胞,随着基因的表达执行对肿瘤的杀伤或抑制,从而达到治疗目的。相比传统治疗,基因治疗是最有可能从根本上根除肿瘤的方法。基因治疗所面对的最大瓶颈是缺乏有效的运送载体。非病毒基因载体因其化学结构可控、易于大量制备、不限制载体容量、低毒低免疫反应等优点,已成为本领域的研究热点。阳离子聚合物聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)由于具有相对较高的转染效率,成为近年来研究的热点。但大量研究表明,PEI要作为临床治疗工具,仍存在三个问题需要解决:1.毒性和转染效率之间的矛盾。高分子量的PEI(high molecular weight polyethyleneimine,HMW PEI)具有高的转染效率,但与此同时,存在毒性强的缺点,反之低分子量PEI(low molecular weight polyethyleneimine,LMW PEI)虽然毒性小,但低转染效率又成为其限制条件;2.缺乏特异的肿瘤靶向性。PEI依靠其表面携带的大量正电荷与细胞结合,缺乏对肿瘤细胞的特异选择性,限制其转染效率进一步提高;3.体内转染效率较低。期冀基因治疗最终能够应用于临床,但目前PEI或者PEI衍生物的体内转染效率远远低于体外。为了解决PEI作为基因载体存在的三个问题,本课题同时从三个点切入,设计合成了一种新型的非病毒载体。首先以低分子量PEI(2 KDa)作为载体骨架,利用改性的两亲性壳聚糖OTMCS交联低分子量PEI得到高分子量PEI衍生物OTMCS-PEI。同时连接能特异结合肿瘤细胞及其新生血管高表达的整合素αvβ3的RGD肽、细胞穿膜肽TAT(49-57)、核定位信号肽NLS,设计合成一种能靶向于肿瘤细胞,促进穿膜并提高核递送能力的三功能肽RGD-TAT-NLS(命名为R18)。利用交联技术将OTMCS-PEI与R18偶联,合成新型非病毒基因载体OTMCS-PEI-R18。本文评价了该载体的理化性质和体内外转染效率,并初步探究了该载体系统的入胞及胞内运转机理。为了呈现直观的评价效果,PEI 25 KDa、OTMCS-PEI、OTMCS-PEI-R13作为实验对照。本文第一部分,探讨了PEI作为非病毒基因载体的研究现状,在研究过程中存在的主要问题,并讨论了可能的优化策略。第二部分,OTMCS-PEI-R18的合成及表征。首先采用固相法制备三功能肽R18,并通过电喷雾质谱分析(MS)鉴定其序列,高效液相(HPLC)测定其相对百分含量,由MS及HPLC分析知,已按照设计序列成功合成了纯度为95.56%多肽R18。将活化的两亲性壳聚糖OTMCS与PEI 2 KDa连接形成OTMCS-PEI高分子聚合物,利用SMCC及半胱氨酸(Cys)的巯基将R18与OTMCS-PEI偶联得到最终产物OTMCS-PEI-R18。由氢核磁共振(1H-NMR)分析知三功能肽R18已成功偶联于OTMCS-PEI聚合物分子上。第三部分,考察了OTMCS-PEI-R18的理化性质。利用凝胶渗透层析色谱法(GPC)测定经不同时长37℃孵育后水解产物的分子量大小,评价其水解性能;利用Zeta电位仪测定其粒径大小及表面电位;使用酸碱滴定法及透射电镜考察阳离子聚合物的缓冲能力和聚阳离子/DNA复合物的结构形态;借助琼脂糖凝胶电泳,考察阳离子聚合物对DNA的包合及保护能力;以Hela细胞,B16细胞为工具细胞,采用MTT法考查OTMCS-PEI-R18/DNA复合物的细胞毒性。结果表明,聚合物在37℃下能够逐渐水解,最终(60 h)水解为小分子物质。透射电镜下可观察到复合物呈类球形,粒径约150-450 nm,电位适中,缓冲能力良好。OTMCS-PEI-R18与DNA质量比约为为1.0时可将DNA完全包裹,并保护DNA抵抗高浓度肝素钠、DNase I及血清的解离,细胞毒性与PEI 25 KDa相比显著降低。第四部分,从体外(细胞)、体内(动物)两方面考察OTMCS-PEI-R18/DNA复合物体的转染效率。以绿色荧光蛋白质粒(p EGFP-N2)和萤火虫荧光素酶质粒(p GL3-Control)为报告基因,考察复合物对Hela细胞和B16细胞的转染能力。并建立小鼠肿瘤模型,以萤火虫荧光素酶质粒(p GL3-Control)为报告基因,考察荧光素酶在各组织的表达和分布情况。结果表明,OTMCS-PEI-R18/DNA复合物的体内外转染效率明显高于对照组,随着阳离子聚合物质量比增大,转染效率逐渐升高,同时随着三功能肽R18的投料比增大,体内外转染效率也随之提高。更值得关注的是,偶联R18后,报告基因在体内的分布得到了改善,更多的聚集于肿瘤组织,萤火虫荧光素酶在肿瘤的表达量明显高于其他组织。第五部分,OTMCS-PEI-R18/DNA复合物胞内转运的初步研究。借助不同内吞途径抑制剂、胞内运转抑制剂,考察复合物的内吞、细胞质内运转及入核途径;采用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记OTMCS-PEI-R18,借助激光共聚焦显微镜实时考察复合物在细胞内的分布。结果表明,由受体介导的入胞途径及胞内运转被抑制后,与OTMCS-PEI、OTMCS-PEI-R13相比,OTMCS-PEI-R18/DNA复合物的转染效率明显减低,表明连接R18后,转基因系统更多的依赖于受体介导途径入胞转运;而细胞分裂活动被抑制后,OTMCS-PEI-R18/DNA复合物的转染效率则高于未连接R18的情况,表明该复合物的入核过程不依赖细胞分裂,更适合于体内的非分裂细胞转染。激光共聚焦实验也证实连接R18后,复合能够大量的聚集于细胞核。本课题通过双亲性壳聚糖连接LMW PEI获得PEI衍生物,并设计具有靶向肿瘤、促进穿膜及核递送特性的三功能肽R18,利用交联技术将之偶联于OTMCS-PEI,获得新型非病毒基因载体OTMCS-PEI-R18。该载体细胞毒性低,转染效率高,特别是体内转染效率明显提高,并且显示了良好的肿瘤靶向性。机制研究证明了其受体介导的特异性入胞及运转方式,适宜体内非分裂细胞的转染。
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【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R450

【参考文献】