FcγRⅢB通过诱导中性粒细胞凋亡促进脓毒症疾病进展的实验研究

发布时间：2018-02-22 08:55

本文关键词： Fcgr3B 拷贝数变异脓毒症脓毒症 FcγRⅢB Fcgr3B 中性粒细胞凋亡 FcγRⅢB Fcgr3B 中性粒细胞凋亡 TNF-α　出处：《浙江大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：前言脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征(SIRS),是临床常见的急危重症,是急性肾损伤(AKI)的主要致病原因,发病率和死亡率均居高不下。明确脓毒症的发病机制,寻找脓毒症发病的易感基因,探索新的有效的治疗方案,已成为全球急危重症医学的研究热点。近年来研究认为,脓毒症是一种微循环障碍疾病。脓毒症疾病进展与组织血氧供需失衡有关。若微循环障碍得不到及时纠正,脓毒症患者便会进展至多器官功能障碍阶段,死亡率极高。中性粒细胞是外周血中数量最多的白细胞,是机体抵御病原体入侵的第一道防线。中性粒细胞凋亡在脓毒症疾病进展的不同时期具有不同的作用。脓毒症疾病进展早期,机体处于炎症爆发,免疫亢进阶段,中性粒细胞作为主要的炎症源,其凋亡有利于抑制炎症反应；但在脓毒症疾病进展晚期,机体处于免疫抑制阶段,中性粒细胞的凋亡导致其穿越血管壁进入炎症病灶消灭病原体的能力减弱,且中性粒细胞凋亡后产生的凋亡小体不能被巨噬细胞清除。凋亡小体不仅是新的炎症源,还会堵塞微血管,造成组织缺氧。上述因素均不利于脓毒症患者的预后。FcγRⅢB是唯一表达于人中性粒细胞表面的Fc伽玛受体。目前研究认为,FcγRⅢB表达缺陷的个体不易发生细菌感染,且FcγRⅢB具有调控中性粒细胞凋亡的作用。本研究旨在探索FcγRⅢB在脓毒症疾病进展晚期时对中性粒细胞凋亡的调控作用,以及FcγRⅢB对脓毒症疾病进展的影响。编码FcγRⅢB的基因Fcgr3B具有拷贝数变异(CNV)的特点。拷贝数变异是一种与疾病易感性及个体差异性相关的基因改变。目前研究认为,Fcgr3B基因的拷贝数变异与系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病相关。本研究希望通过检测重症脓毒症患者Fcgr3B基因拷贝数的情况,来了解FcγRⅢB在脓毒症中的作用,以及Fcgr3B基因拷贝数多态性是否为脓毒症患者个体差异性表现的一个原因。FcγRⅢB是一种GPI锚定蛋白,胞内段缺陷。因此FcγRⅢB需要通过其它具有胞内段的信号分子来达到向细胞内传递信号的目的,例如FcγRⅢB或Mac-1。目前研究认为,FcγRⅢB具有调节中性粒细胞凋亡和吞噬功能的作用。本研究通过检测FcγRⅢB在脓毒症体内环境下对中性粒细胞凋亡及吞噬功能的影响,来了解FcγRⅢB在脓毒症疾病进展过程中的作用；并通过体外实验验证FcγRⅢB与中性粒细胞凋亡之间的关系,寻找关键作用因子。第一部分Fcgr3B基因拷贝数多态性与重症脓毒症的相关性研究目的通过检测重症脓毒症患者和健康人群Fcgr3B基因拷贝数变异的情况,来了解FcγRⅢB在脓毒症中的作用,以及Fcgr3B基因拷贝数多态性是否为脓毒症患者个体差异性表现的一个原因。方法提取468例重症脓毒症患者及450例健康人外周血DNA,以Fcgr3B基因2拷贝的DNA样本为标准品,实时荧光定量PCR标准曲线法检测其Fcgr3B基因拷贝数。比较重症脓毒症患者和健康人群之间Fcgr3B基因拷贝数的差异。结果重症脓毒症患者中Fcgr3B基因0,1,2,3,4,5,和6拷贝的频率分别为0.2%,18.6%,51-3%,26.5%,1.9%,0.4%,和1.1%;健康人群中Fcgr3B基因0,1,2,3,4,5,和6拷贝的频率分别为2.4%,39.3%,47.3%,6.9%,2.7%,0.9%,和0.4%。以Fcgr3B基因2拷贝为界,定义2拷贝为低拷贝组,2拷贝为高拷贝组,重症脓毒症患者中Fcgr3B基因2拷贝,2拷贝,和2拷贝的频率分别为18.8%,51.3%,和29.9%；健康人群中Fcgr3B基因2拷贝,2拷贝,和2拷贝的频率分别为41.8%,47.3%,和10.9%；重症脓毒症患者高拷贝个体频数明显高于健康人群(卡方值84.01,自由度2,P0.0001)。Logistic回归分析提示,Fcgr3B基因高拷贝个体发生感染后进展至重症脓毒症的可能性较大(OR=2.536,95%可信区间1.745-3.686,P0.0001)；而Fcgr3B基因低拷贝个体发生感染后进展至重症脓毒症的可能性较小(OR--0.415,95%可信区间0.304-0.568,P0.0001)。结论中国汉族人群中Fcgr3B基因高拷贝(2拷贝)个体发生感染后进展至重症脓毒症的可能性更大。Fcgr3B基因拷贝数多态性是脓毒症患者个体差异性表现的一个原因。第二部分中性粒细胞FcγRⅢB在小鼠脓毒症模型中的作用研究目的通过建立Fcgr3B转基因小鼠盲肠结扎穿孔(CLP)脓毒症模型,来研究FcγRⅢB在脓毒症疾病进展中的作用。方法实验组Fcgr3B+转基因小鼠基因型为Fcgr3B+Fcer1g+/+, Fcgr3B+Fcer1g-/-和Fcgr3B+Fcgr2A+Fcer1g-/-,对照组Fcgr3B-转基因小鼠基因型为Fcer1g+/+(野生型)和Fcer1g-/-,均为C57BL/6小鼠,均通过基因鉴定入组实验。以上5种基因型小鼠均分为CLP脓毒症模型组和假手术组,分别观察各基因型小鼠脓毒症组的生存时间,并检测各基因型小鼠脓毒症组和假手术组的血乳酸水平,血TNF-α水平,中性粒细胞凋亡水平,和中性粒细胞吞噬功能情况。结果实验组Fcgr3B+转基因脓毒症小鼠的死亡率高于对照组Fcgr3B-转基因脓毒症小鼠(P0.05)。各基因型小鼠均在CLP术后20小时开始出现死亡。为了模拟重症脓毒症的疾病进展过程,我们选择CLP术后20小时为观察点,比较以下各项指标的差异。实验组Fcgr3B+转基因脓毒症小鼠的血乳酸水平,血TNF-α水平,中性粒细胞凋亡水平均高于对照组Fcgr3B-转基因脓毒症小鼠(P0.05)；各基因型小鼠脓毒症组血乳酸水平,血TNF-α水平,中性粒细胞凋亡水平均高于假手术组(P0.05)。实验组Fcgr3B+转基因脓毒症小鼠中性粒细胞的吞噬功能低于对照组Fcgr3B-转基因脓毒症小鼠(P0.05)；各基因型小鼠脓毒症组中性粒细胞吞噬功能均低于假手术组(P0.05)。结论Fcgr3B+脓毒症小鼠表现出显著的高死亡率,高血乳酸水平,高促炎因子TNF-α水平,其中性粒细胞凋亡增加,而吞噬功能减弱。以上结果提示FcγRⅢB在脓毒症体内环境下具有促进中性粒细胞凋亡的作用,且FcγRⅢB的这种作用削弱了机体的免疫力,促进了脓毒症疾病的进展。第三部分FcγRⅢB与中性粒细胞凋亡关系的体外研究目的通过体外实验验证FcγRⅢB与中性粒细胞凋亡之间的关系,寻找关键作用因子。方法分别提取健康Fcgr3B+Fcer1g+/+, Fcer1g+/+(野生型),Fcgr3B+Fcer1g-/-Fcgr3 B+Fcgr2A+Fcer1g-/-, Fcer1g-/-小鼠的骨髓中性粒细胞,平均分为4份,分别是空白对照组(对照组1)、TNF-α刺激组(对照组2)、TNF-α+二抗刺激组(对照组3)、和TNF-α+FcγRⅢB交联刺激组(实验组),比较各组细胞之间的凋亡水平和凋亡相关信号分子的表达程度。结果Fcgr3B+转基因小鼠]TNF-α+FcγRⅢB交联刺激组中性粒细胞的凋亡水平明显高于其它对照组(P0.05)；而Fcgr3B-转基因小鼠TNF-α+FcγRⅢB交联刺激组中性粒细胞的凋亡水平与其它对照组相比,无明显差异。Western blot提示Fcgr3B+转基因小鼠TNF-α+FcγRⅢB交联刺激组中性粒细胞的活化型caspase8,活化型caspase 3, SHIP和磷酸化型SHIP的表达水平均高于其它对照组；而Fcgr3B-转基因小鼠TNF-α+FcγRⅢB交联刺激组中性粒细胞的凋亡相关信号分子的表达水平与其它对照组相比,无明显差异。结论体外实验证明FcγRⅢB联合TNF-α具有促进中性粒细胞凋亡的作用,此过程与信号分子Caspase 8,Caspase 3和SHIP的活化有关。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R459.7

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