异基因造血干细胞移植术后中枢T细胞免疫重建的初步研究

发布时间：2018-06-08 07:45

本文选题：造血干细胞移植 + 中枢免疫　；参考：《南方医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：研究背景及目的造血干细胞移植(HSCT, hematopoietic stem cell transplantation)是治疗恶性血液系统疾病及部分遗传性疾病的有效手段。自1965年的第一例异基因骨髓移植得到成功后,HSCT在近几十年来获得了巨大的进展,目前每年全球有近十万人次接受HSCT的治疗。移植前大剂量的放化疗摧毁了患者体内正常的造血和免疫功能,保证移植的异基因造血干细胞在受者体内分化、发育成熟并重建造血功能和免疫功能。移植后骨髓造血可以较快的重建,但免疫功能重建需要比较长的时间。移植后免疫重建延迟导致免疫细胞功能严重低下,患者在移植后对各种病菌的抵抗力明显下降,容易并发感染,同时由于免疫功能重建延迟导致免疫监督清除功能低下使恶性血液病容易复发。现在感染和疾病复发已经成了造血干细胞移植术后常见的死亡原因。移植后的免疫重建包括细胞免疫和体液免疫的重建,以细胞免疫的重建最为重要。造血干细胞移植后首先是中性粒细胞的数量恢复,中性粒细胞数量恢复正常使受者具有一定的抗感染免疫,一般恢复时间大约14-21天。接着是自然杀伤(NK,natural killer)细胞及单核细胞的数量恢复,一般在移植后的14-60天可恢复至移植前的水平,NK细胞数量的正常使受者具有一定的抗病毒免疫功能,但其功能的成熟需要较长时间。CD8+T细胞和B细胞数量的恢复,一般持续2-8个月,B细胞数量的正常使患者有能力产生抗体,但体液免疫功能恢复完全正常仍需要较长时间,一般可能需要1-2年。CD4+T细胞是细胞毒的主要效应细胞,具有抗特殊细菌感染和对突变细胞清除的免疫监督作用。移植后CD4+数量恢复时间最慢,在人白细胞抗原(HLA)全相合移植的病人中,一般需要1-2年时间才能恢复,而在单倍体相合移植模式下细胞数量恢复正常甚至需要5年时间。T细胞免疫重建主要存在两条路径：(1)非胸腺依赖路径：移植初期外周血淋巴细胞的快速增殖是来源于外周血中存在的初始T细胞及记忆T细胞,这两类细胞主要是由移植物中供者来源的成熟T细胞,受者在经过预处理后体内所残留的部分初始T细胞及记忆细胞,另外也包括移植后接受供者淋巴细胞输注治疗时所输入的供者T细胞所构成。但是由于这条路径不能产生新生的初始T细胞,因而只能在移植初期对机体有免疫保护作用。对于一个具有完整功能的适应性免疫系统,需要新生初始T细胞持续不断的产生以及迁移至外周淋巴器官中才能很好的维持免疫功能,因而移植后T细胞免疫重建主要还是依赖胸腺途径。(2)胸腺依赖途径：正常生理情况下,T细胞的发育及成熟主要是在胸腺完成。骨髓中造血干细胞分化成淋巴祖细胞,然后迁移至胸腺,经历胸腺中阴性及阳性选择的成熟过程,最终成熟为对主要组织相容性复合体(MHC, major histocompatibility complex)有限制性识别能力,同时保留了对自身抗原耐受即仅能识别非己抗原的初始T淋巴细胞。一般经过这一过程,仅只有小于5%的新生初始T淋巴细胞能够从胸腺中输出至外周的淋巴器官中。由此可见,胸腺功能在T细胞免疫重建中担当着极其重要的角色。如何判断T细胞重建功能是目前临床上常遇到的问题。流式细胞技术的发展可以很方便的检测T细胞亚群数量及百分比。但是流式细胞技术很难区分T细胞的来源,是来源于供者记忆T细胞增殖还是来源于中枢免疫器官即胸腺新生T细胞,目前无法通过该技术得到答案。T细胞受体删除环(TREC,T-cell receptor excision circle)是T细胞发育成熟过程中,T细胞受体(TCR, T-cell receptor)-α基因重排时产生的一段环状DNA,该环状DNA可稳定保存在细胞中,不会随着细胞的分裂而扩增,因而会逐渐被稀释,其数量可以代表拥有功能多样性TCR基因的初始T细胞数量。TREC的拷贝数可以通过实时定量聚合酶链式反应(PCR, polymerase chain reaction)技术检测和计算,相对客观的的反应胸腺近期输出初始T细胞的数量,以此判断体内新生T细胞和胸腺的功能状态。移植后中枢免疫重建的研究已有许多相关报道,许多研究发现预处理方案、移植物抗宿主病(GVHD)、GVHD预防措施、移植时的疾病状态以及移植物来源与成份都影响移植后中枢免疫功能即新生CD4+T细胞的重建。清髓性的预处理主要影响胸腺上皮细胞的数量及功能,同时引起T淋巴祖细胞增殖、分化及迁移所需的细胞因子和趋化因子的分泌减少。在小鼠中已观察到移植前的放疗剂量会显著损伤移植后胸腺输出淋巴细胞的数量与质量,这可能是大剂量的放疗使得胸腺基质细胞功能发生改变或缺失,因而细胞发育成熟所必需的细胞因子及趋化因子分泌减少,最终影响到了胸腺上皮细胞的数量及功能变化。移植后GVHD可引起胸腺的形态改变,表现在胸腺细胞的减少以及基质细胞成分的改变,已有研究通过TRECs方法检测证实GVHD能损伤胸腺的淋巴细胞输出数量。此外GVHD也可干扰胸腺细胞的成熟,在GVHD模型小鼠上,由于胸腺上皮细胞成分及结构的改变,使得胸腺中T细胞发育和分化选择出现了障碍。自1998年,我们中心建立了清髓性FBCA预处理方案(包括氟达拉滨、白舒非、环磷酰胺及兔抗人胸腺球蛋白)联合G-CSF动员外周血造血干细胞的非体外去T细胞移植方案,到目前已经治愈了很多血液疾病患者。难治复发的高危白血病患者在接受了该方案移植后5年长期生存可达35%,而中危患者5年长期生存可达60%左右。但是同样,移植后感染和复发是移植后患者死亡的重要原因,在我们建立的方案下移植后复发率大约是20%,而移植后巨细胞病毒感染是60%左右。国内、外不同移植中心用不同移植方案进行了造血干细胞移植,移植后对中枢免疫重建的研究也有报道,与这些研究相比,在我们中心建立的FBCA预处理非体外去T细胞异基因造血干细胞移植模式,其免疫重建及中枢免疫的重建情况如何?中枢免疫功能与移植后感染、GVHD及复发的关系如何?尚没有系统的统计与分析。本研究以我院用清髓性FBCA预处理方案接受HSCT的移植患者为研究对象,测定移植后不同时间点T细胞各亚群(CD3+/CD4+/CD8+)数量和TREC拷贝数,并将其与年龄、移植后感染、GVHD、复发等因素进行分析,初步探究在该清髓性FBCA预处理联合G-CSF动员外周造血干细胞的非体外去T细胞移植模式下,患者移植后T细胞免疫重建特别是中枢免疫重建的一般规律,以及同移植后预后因素的相关关系。研究方法1.研究对象选取2013年1月到2014年1月在我院血液科行HSCT的部分血液疾病患者。共有20例患者入组研究,中位年龄18岁(3-47岁),其中12例年龄小于20岁,8例年龄大于等于20岁,男性11例,女性9例。6例患者诊断为急性髓系白血病(AML),4例患者诊断为急性淋巴细胞白血病(ALL),2例患者诊断为慢性髓系白血病(CML),5例诊断为再生障碍性贫血(SAA),2例诊断为地中海贫血,1例诊断为骨髓增生异常综合症(MDS)。按照危险度分层,7例患者诊断为中危,13例为高危。2.造血干细胞移植患者的健康亲属作为供者选择的来源,采用直接核苷酸序列分析(SBT, Sequenceing-based typing,高分辨分型)以及微量序列特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP, sequence-specific primers PCR,中分辨分型)技术进行供受者HLA配型,选择高分辨分型至少5个位点以上或者中分辨分型至少3个位点以上相合的亲属作为供者。20例患者均采用我们建立的FBCA预处理方案：氟达拉滨Flu 30mg/m2(-9至-5d)；白舒非BU 0.8mg/kg/q6h(-8至-5d)；环磷酰胺CY60mg/kg(-3至-2d)；兔抗人胸腺细胞球蛋白ATG,全相合移植患者1.25mg/kg/d(-3至-1d),单倍体相合患者2.5 mg/kg/d(-5至-1d)。移植物采用粒细胞集落刺激因子(G-CSF, granulocyte colony-stimulating factor)动员的外周血干细胞,不做体外去T细胞处理。GVHD的预防措施包括常规的环孢素(CsA,3mg/kg/d)以及甲氨蝶呤(MTX,15mg/m2+1d,10mg/m2+3/+6/+11d)的应用,环孢素一般在移植后180天逐渐减量停用。在输注干细胞后每日使用G-CSF以及重组人血小板生成素(rhTPO, Recombinant human-thrombopoietin)等直至造血重建的恢复。3. T细胞亚群数量检测采集患者在移植后+1月、+3月、+6月以及+12月的外周血,采用流式细胞术分析的方法,监测移植后+1月、±3月、±6月以及+12月患者外周血中CD3+、 CD4+及CD8+T细胞亚群的数量,了解患者外周的T细胞免疫状态。4. 外周血TREC水平的监测采集患者移植后+1月、+3月、+6月以及+12月的外周血中的单个核细胞(PBMNC, peripheral blood mononuclear cell),用试剂盒提取基因组DNA。采用文献中报道的引物(暨南大学血液病研究所李扬秋教授赠送),采用实时定量PCR方法检测患者外周血中100000个PBMNCs中TREC的拷贝数,评估患者的胸腺近期输出T细胞功能。5. 移植后相关因素与免疫重建的关系将患者移植后外周血T淋巴细胞亚群绝对数以及TREC拷贝数,采用SPSS17.0软件进行统计分析T淋巴细胞亚群数、TREC及同移植后相关因素(包括年龄、感染、GVHD、复发)的关系,双边检验P值小于0.05为有显著意义。结果1.在我院清髓性FBCA预处理的HSCT后,20例进入研究统计。20例患者移植后均造血重建,STR-PCR检测均为供者细胞完全植入。中性粒细胞植入的中位时间为13天(11-18天),血小板植入的中位时间为14天(%20天)。移植后100天内发生急性GVHD (aGVHD, acute graft-versus-host disease)的发生率为35%,aGVHDⅠ度的患者6例,aGVHD Ⅱ度的患者1例,没有严重aGVHD的发生。移植后慢性GVHD (cGVHD, chronic graft-versus-host disease)的发生率为15%,3例患者出现局限性的cGVHD。4例患者出现复发,本组病人的复发率为20%。20例患者中只有1例死亡,死亡原因为复发及肝脏、肠道Ⅳ度GVHD。2.所有患者在移植后1个月外周血CD3±细胞数339.72±69.79/μL,移植后3个月CD3+细胞数上升至405.88±85.68/μL,到6个月时细胞数上升为810.05±208.11/μL,在移植后12个月时为1207.99±250.72/μL; CD4+细胞在移植后1个月为细胞数138.98±41.96/μL,移植后3个月CD4+细胞数下降至126.50±17.02/μL,到6个月时细胞数上升为228.91±66.95/μL,在移植后12个月时为358.14±195.46/μL：CD8+细胞数在移植后1个月、3个月、6个月以及12个月时分别为255.63±47.23/μL、371.91±62.69/μL、775.82±73.26/μL及971.87±138.56/μL。3.20例患者移植后1个月外周血TREC拷贝数为0.93±2.45拷贝/105细胞,3个月时为7.56±7.64拷贝/105细胞,6个月及12个月分别为85.83±54.80拷贝/105细胞和148.62±77.61拷贝/105细胞。与正常人相比,20例患者移植后不同时间外周血TREC拷贝数均低于正常人群,但随移植时间的延长,TREC数量增加,表明中枢免疫功能的重建随移植后时间的延长逐渐恢复,与CD4+T细胞比较TREC恢复更慢。4.进一步分析表明,年龄对免疫功能的重建有一定影响。年龄≥20岁患者在移植后不同时间外周T细胞亚群绝对数均低于年龄20岁患者,尤其是在移植后6个月以及12个月的CD4+细胞数上是有显著性差异(P值分别为0.028以及0.0001)。而反映中枢免疫功能重建的TREC拷贝数,年龄20岁患者在移植后6个月及12个月的TREC拷贝数也明显低于年龄20岁组的病人(P值分别为0.012以及0.002)。这些结果提示无论是外周T细胞还是反映中枢免疫功能的TREC,年轻患者更容易在移植后重建。5.移植后感染与移植后免疫功能状态有非常密切的关系,中枢免疫重建延迟与移植后迟发霉菌感染有关。20例患者移植后17例病人出现不同程度的感染。其中年龄20岁组移植后6个月内,12例出现EB病毒感染,13例CMV感染,,3例出血性膀胱炎,2例单纯疱疹病毒感染,1例肺部霉菌性感染,而年龄≥20岁组移植6个月内,5例出现EB病毒感染,5例CMV感染,4例出血性膀胱炎,1例单纯疱疹病毒感染,1例肺部霉菌性感染。移植6个月后,年龄20岁组只有1例出现肺部霉菌感染,而年龄≥20岁组出现5例肺部霉菌感染,1例单纯疱疹病毒。移植6个月后发生霉菌感染的患者在移植后12个月CD4+T细胞数及低于未发生霉菌感染的人(P值为0.046),而且移植后6个月及12个月的TREC拷贝数平均水平也要低于未发生感染的患者(P值分别为0.044及0.003)。无论是aGVHD、cGVHD或复发患者,与未发生该事件的患者相比两者移植后T细胞数量恢复及TREC拷贝数统计学上无显著性差异。结论1.在我们建立的FBCA预处理及G-CSF动员外周血干细胞的非体外去T细胞移植方案下,患者在移植后的免疫重建需要较长时间,移植后1年中枢免疫功能尚未恢复正常,与国内外类似研究结果是相似的。2.年龄是影响移植后中枢免疫重建的重要因素,中枢免疫功能的重建低下与移植后迟发霉菌感染相关。年龄20岁组移植后T细胞重建快于年龄≥20岁组,年龄20岁的患者在移植后期发生霉菌感染次数明显少于年龄≥20岁组的患者,进一步发现发生霉菌感染的患者T细胞重建慢于未发生霉菌感染者,这提示移植后年龄20岁组在移植远期较少的感染可能同年轻患者胸腺功能较好,T细胞免疫恢复快有关。3.接受异基因造血干细胞移植的患者在移植后胸腺近期输出功能低于正常人水平。而移植后胸腺近期输出功能同移植后中枢免疫重建密切相关,促进及改善移植后胸腺功能也许可能是克服移植后免疫重建延迟的途径。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R457.7

【参考文献】