STR基因座复合扩增体系建立及其在造血干细胞移植嵌合体检测中的应用

发布时间：2018-06-25 17:04

  本文选题：短串联重复序列 + 复合扩增　； 参考：《福建医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：目的:建立包括D3S1358、D13S317、D7S820、CSF1PO、D16S539、D12S391、D18S51、Amelogenin、D5S818和FGA10个STR基因座的荧光标记复合扩增体系,探讨该体系用于检测造血干细胞移植嵌合体的可行性。方法:选取D3S1358、D13S317、D7S820、CSF1PO、D16S539、D12S391、D18S51、Amelogenin、D5S818和FGA10个STR基因座。D3S1358、D13S317、D7S820、CSFIPO上游引物的5'端用6-FAM标记,D16S539、D12S391、D18S51上游引物的5'端用HEX标记,Amelogenin、D5S818、FGA上游引物的5'端用TAMRA标记。优化STR基因座复合扩增体系中的引物浓度、DNA模板浓度、退火温度、循环次数等参数,建立最佳复合扩增体系。运用传统的制备方法,制备10个STR基因座常见基因型的等位基因分型标准物。分析本方法与Sinofiler试剂盒所检测的等位基因的一致性;检测DNA灵敏度;制备体外模拟嵌合体样本,分析每组测得的嵌合率平均值与理论嵌合率的差异;进行重复性实验;比对本方法与Sinofiler试剂盒检测造血干细胞移植标本嵌合体的相关性。结果:建立了10个STR基因座的复合扩增体系:总体积25μL,10′Go Taq Buffer5μL,2.5mmol/L d NTP3μL,10μmol/L的各基因座D3S1358、D13S317、D7S820、CSF1PO、D16S539、D12S391、D18S51、Amelogenin、D5S818、FGA引物分别为0.5μL、0.4μL、0.7μL、0.55μL、0.45μL、0.5μL、0.5μL、0.6μL、0.7μL、0.7μL,Go Taq DNA聚合酶0.3μL、10ng/μL的DNA 3μL,去离子水8.1μL。热循环参数:95℃5min;94℃45s,59℃45s,72℃45s,30次循环;60℃55min;15℃∞。用本方法和Sinofiler试剂盒检测423份样本等位基因分型结果完全一致。该体系能检测最低DNA浓度为0.4 ng/μL。模拟嵌合体样本,最小检出的供者嵌合率范围为2.5%-5%。r=0.998,回归方程y=0.9835x+0.7829 R2=0.997。批内和批间重复性实验,结果显示标准差均小于2%,批内变异系数为3.75%,批间变异系数为1.23%-7.97%。用本方法和Sinofiler试剂盒检测104份造血干细胞移植后嵌合体样本,两方法的r=0.997,线性回归方程y=1.0108x-0.8418 R2=0.9941。结论:成功构建了D3S1358、D13S317、D7S820、CSF1PO、D16S539、D12S391、D18S51、Amelogenin、D5S818和FGA10个STR基因座复合扩增体系,该体系可应用ABI3100检测平台,获得可靠的分型结果。本复合扩增体系可检测出造血干细胞移植嵌合体的供体嵌合率,灵敏度高、特异性强,完全能够满足临床需要。同时也为开发国产STR试剂盒打下了良好的基础。
[Abstract]:Objective: to establish a fluorescent multiplex amplification system including D3S1358-D13S317D7S820 CSF1POF1POF1D16S539D12S391D18S51Amelogenin D5S818 and FGA10 STR loci, and to explore the feasibility of using the system to detect chimerism in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Methods: D3S1358-D13S317D7S820 CSF1POF1POD16S539D12S391D12S391D18S51Amelogenin D5S818 and FGA10 STR loci. D3S1358-D13S317D7S820CSFIPO upstream primer 5'end was labeled with MRTAA at the 5'end of the primer D16S539D12S39S51 upstream using HEX to mark the 5'end of the upstream primer of Amelogenin D5S818FGA. The optimal amplification system was established by optimizing the primer concentration and DNA template concentration, annealing temperature and cycle times of STR locus multiplex amplification system. The allelic alleles of 10 STR loci were prepared by traditional preparation method. To analyze the consistency of alleles detected by this method and the Sinofiler kit, to detect DNA sensitivity, to prepare in vitro simulated chimerism samples, to analyze the differences between the average and theoretical chimerism rates measured in each group, and to carry out repetitive experiments. To compare the correlation between this method and Sinofiler kit for detecting chimerism in hematopoietic stem cell transplantation specimens. 缁撴灉:寤虹珛浜，

本文编号：2066855