内含不同类型RNA的重组MS2噬菌体病毒样颗粒的表达及其应用研究

发布时间：2018-07-07 14:59

本文选题：H7N9禽流感病毒 + MS2噬菌体病毒样颗粒　；参考：《北京协和医学院》2015年博士论文

【摘要】：H7N9禽流感病毒是一种新亚型流感病毒,于2013年3月在我国上海和安徽两地率先发现。H7N9禽流感病毒感染后的死亡率较高,因此对该病毒早期准确的诊断成为挽救患者生命的关键。作为一种RNA病毒,H7N9禽流感病毒的实验室检测包括病毒核酸提取、逆转录和扩增等多个步骤,每一步操作不当均会导致检测出现假阳性或假阴性结果,误导临床诊断,延误患者的治疗。为了提高全国医院实验室和流感监测网络实验室H7N9禽流感病毒的检测能力,2013年7月卫生部临床检验中心组织了一次室间质量评价。我们制备了基于MS2噬菌体病毒样颗粒(Bacteriophage MS2 virus-like particles, MS2 VLPs)的内含H7N9禽流感病毒血凝素(Hemagglutinin, HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)、基质蛋白(Matrix protein, MP)和核蛋白(Nucleoprotein, NP)四种蛋白全长RNA序列的质控品,向全国参与H7N9病毒检测的医院实验室和流感监测网络实验室发放,以评价参评实验室H7N9禽流感病毒的检测能力,指导实验室提高检测水平。所发放的样本盘含有10个样本,其中包括6个含不同浓度H7N9禽流感病毒基因的阳性样本和4个H7N9阴性样本(包括1个MP基因阳性的样本)。样本盘发放到全国79家进行H7N9禽流感病毒分子检测的实验室,并根据实验室H7和N9两个基因的检测情况对结果进行了分析。我们共收到80份回报结果(其中一家实验室回报了2份结果),其中77份结果采用real-time RT-PCR方法进行检测：60份采用商品化试剂盒检测,17份采用实验室自配试剂检测；还有3份结果采用等温扩增法检测。统计结果显示82.5%的实验室能够正确检测不同浓度的H7N9禽流感病毒样本及阴性样本。但是仍有17.5%的实验室需要改进检测能力,有待改进的实验室中大部分漏检了相对较低浓度的N9基因。总体检测的假阴性率为5.6%,假阳性率为0.6%,选用不同的检测试剂盒和检测方法得出的结果不尽相同。本次室间质量评价的结果表明我国大多数核酸检测实验室具备了H7N9禽流感病毒核酸检测的能力。MS2 VLPs不仅能够包装外源mRNA,还可以用于miRNAs前体的包装,用来作为niRNAs的递送载体。在第二部分中,我们通过对MS2 VLPs表达质粒进行改造,制备了表面展示细胞穿透肽HIV-1 TAT且内含miR-122前体的重组MS2VLPs-TAT-MS2-miR122 VLPs,进一步实验结果显示TAT-MS2-miR122 VLPs能够携带miR-122前体进入Hep3B肝癌细胞系,在细胞内加工成成熟的miR-122,使Hep3B细胞内miR-122表达水平升高,高表达的miR-122通过对肿瘤相关靶蛋白的调节发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。这一部分中我们将两条重复的MS2噬菌体衣壳蛋白编码序列串联组成单链二聚体,并在单链二聚体序列的N端插入带有连接臂的穿透肽HIV-1 TAT的cDNA序列,随后把这一嵌合序列构建到真核表达质粒pESC-URA的Gal 10启动子下游；将与包装位点序列串联的pre-miR-122序列构建到Gal 1启动子的下游,构建完成的表达质粒转化到酿酒酵母细胞中,摇菌表达得到TAT-MS2-miR122 VLPs。结果显示采用不同剂量的TAT-MS2-miR122 VLPs处理三种不同类型的细胞,均检测到miR-122表达水平不同程度的升高,可持续稳定约120小时。TAT-MS2-miR122 VLPs处理Hep3B细胞后,伴随着miR-122水平的升高,Western Blot检测到miR-122的两个靶蛋白胰岛素样生长因子1受体(Insulin-like growth factor 1 receptor, IGF1R)和去整合素样金属蛋白酶10(Adisintegrin and metalloproteinase 10, ADAM 10)表达水平下降。IGF1R和ADAM1 0均在肝细胞癌的发生发展过程中发挥重要作用,两种蛋白表达下降将影响Hep3B细胞的生长。细胞增殖和凋亡实验的检测结果证实了TAT-MS2-miR122 VLPs处理的细胞与阴性对照组相比,细胞增殖明显受到抑制、凋亡细胞数显著增多,可见升高的miR-122发挥了抗肿瘤细胞生长的作用。综上所述,体外实验的结果表明展示穿透肽HIV-1 TAT的重组MS2 VLPs是有效的miRNAs递送载体,该方法制备简单、成本低、产物稳定、细胞摄取率高,具有良好的应用前景。TAT-MS2-miR122 VLPs介导的miR-122升高能否在动物水平抑制肿瘤生长有待进一步研究。
[Abstract]:In order to improve the ability of detecting avian influenza virus in the laboratory and influenza surveillance network in China in March 2013 , there were 10 samples , including 6 positive samples including virus nucleic acid extraction , reverse transcription and amplification . In order to improve the testing ability of the National Hospital Laboratory and Influenza Surveillance Network Laboratory , the results were analyzed . In order to improve the national hospital laboratory and influenza surveillance network laboratory , the results were analyzed . In order to improve the national hospital laboratory and influenza surveillance network laboratory , the results were analyzed .
A recombinant MS2VLPs - TAT - MS - 2 - miR122 VLPs , which was used as a carrier for the detection of HIV - 1 TAT in Hep3B cells , was prepared by modifying the expression plasmid of the tumor - related target protein .
The results showed that the expression of IGF - 2 - miR122 VLPs was significantly inhibited and the number of apoptotic cells increased . The results showed that the expression of IGF - 2 - miR122 VLPs was significantly inhibited and the number of apoptotic cells increased .
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R440

【参考文献】