经Bcl-2基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对缺血性心功能不全兔心功能及血管新生的影响

发布时间：2018-11-22 07:07

【摘要】：目的:本实验旨在观察经抗凋亡基因(Bcl-2)修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对缺血性心功能不全家兔心肌细胞调亡、血管新生及心功能的影响,并探讨其可能机制。方法:BMSCs分离、培养及纯化:采用骨髓穿刺法获取含BMSCs的兔骨髓液,在体外经密度梯度离心+贴壁培养法,获取足量、纯化的BMSCs。重组腺病毒载体的构建:用酶切法将目的基因(Bcl-2)从原始质粒上切下,并与p Shuttle-CMV-EGFP重组穿梭载体连接,然后将p Shuttle-CMV-EGFP-Bcl-2基因片段连接到p Adeno载体上,获得含Bcl-2的重组腺病毒载体质粒。用重组质粒共转染293细胞,收集病毒并大量扩增,经反复冻融后置于-80℃保存待用。转染细胞前,将重组腺病毒液解冻、复苏并进行滴度测定。细胞转染:选取生长状态良好的BMSCs,采用含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的腺病毒及重组Bcl-2-腺病毒分别转染上述细胞。模型制备及细胞移植:将28只新西兰兔随机分为以下3组:MI+BMSCs+Bcl-2组、MI+BMSCs组和MI+DMEM组,分别结扎左冠状动脉前降支制作心肌梗死模型。2周后经心脏超声筛查,将造模成功(心功能不全标准为:LVEF≤50%)的各组家兔于心肌梗死边缘区分别注射等量的腺病毒-Bcl-2转染的BMSCs(MI+BMSCs+Bcl-2组)、腺病毒转染的BMSCs(MI+BMSCs组)及DMEM液(MI+DMEM组)。指标观察:细胞移植后4周再次经超声测定心功能:左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)、左室舒张末内径(LVEDD)及左室收缩末内径(LVESD);切取正常及梗死边缘区心肌组织,制作石蜡及冰冻切片,荧光显微镜下观察移植细胞的存活及分布;采用苏木精-伊红(H-E)染色法评估心肌病理学改变;原位缺口末端标记法(TUNEL)检测心肌凋亡细胞数并计算凋亡率;免疫组化染色检测CD31的表达,计算新生毛细血管密度;RT-PCR检测血管内皮生长因子(VEGF)基因表达。并分别与心功能(LVEF)进行相关性分析。结果:1 BMSCs分离及培养情况:骨髓液经Percoll分离液密度梯度离心后,可见乳白色絮状物层,经反复换液及贴壁培养后获得纯化的BMSCs,24-48h后观察到散在贴壁的纺锤状BMSCs,7-10d时BMSCs呈长梭状,细胞间形成突起,胞核居中,细胞排列疏松,18-21d可见形态规则的单层融合束状贴壁细胞,排列紧密呈漩涡状、放射状。经胰蛋白酶消化融合的BMSCs,以1:2比例进行传代培养,24h后细胞完全贴壁,3-5d后即达80%融合。传至第10代时细胞生长速度逐渐减慢;2本实验成功构建出大量重组腺病毒载体,冻存的病毒液经连续梯度稀释后分别感染293细胞,经观察细胞病变率,计算病毒最终滴度(T)为2.5×1010PFU/ml;3转染后细胞状态:选用生长状态良好的第九代BMSCs,经病毒转染24-48h后,于荧光显微镜下观察到带有绿色荧光蛋白标记(EGFP)的BMSCs,细胞排列整齐,形态均一呈长梭状,经预实验测定MOI值为500时转染效率最佳。4模型建立及动物存活情况:28只新西兰兔接受造模手术,术后共有24只存活,经超声学验证其LVEF均≤50%。其中MI+BMSCs+Bcl-2组存活8只,死亡1只;MI+BMSCs组存活8只,死亡2只;MI+DMEM组存活8只,死亡1只。共死亡4只,2只于结扎前降支过程中诱发室颤死亡,1只造模后呼吸骤停死亡,1只于二次开胸细胞移植后48h死亡。5荧光显微镜下观察细胞存活情况:B M S C s移植后4周,M I+BMSCs+Bcl-2组及MI+BMSCs组在荧光显微镜下均可观察到绿色荧光,MI+DMEM组无绿色荧光。6普通光镜下观察心肌病理学变化:正常心肌细胞形态均一、排列整齐。细胞质染色均匀,呈淡蓝色,胞核大小一致,呈椭圆形或圆形,居胞质中央。梗死边缘区的心肌细胞排列紊乱,心肌纤维部分断裂,细胞间可见多种炎性细胞浸润。梗死区正常心肌细胞形态消失,代之以成纤维细胞及粗大的胶原纤维束,排列较疏松,其间未见炎性细胞浸润。各组梗死边缘区心肌组织与正常心肌组织比较可发现:MI+BMSCs+Bcl-2组病理学改变较轻微,MI+BMSCs组其次,MI+DMEM组较严重。7心肌梗死边缘区细胞凋亡率、新生血管密度及VEGF m RNA表达量:MI+BMSCs+Bcl-2组及MI+BMSCs组凋亡率均较MI+DMEM组降低,其中前者降低更为显著[(30.75±5.65)%,(44.14±5.99)%,(63.38±8.52)%,F=46.00,P0.05];MI+BMSCs+Bcl-2组毛细血管密度及VEGF基因表达量(RQ值)均明显高于MI+BMSCs组,后组又明显高于MI+DMEM组(毛细血管密度:24.25±3.46,14.38±2.92,6.88±2.03,F=74.07,P0.05;RQ:1.64±0.29,0.99±0.17,0.64±0.19,F=40.56,P0.05)。8细胞移植4周后经超声检测各组心功能:与MI+DMEM组相比,MI+BMSCs+Bcl-2组和MI+BMSCs组的LVEF及LVFS均明显升高,LVEDD及LVESD均明显降低,其中MI+BMSCs+Bcl-2组变化更为显著;[LVEF:(66.63±2.67)%,(60.50±3.16)%,(55.25±2.60)%,F=32.532,P0.05;LVFS:(40.50±1.60)%,(34.63±2.33)%,(27.25±2.05)%,F=86.736,P0.05;LVEDD:(10.13±0.64)mm,(12.07±0.59)mm,(13.93±0.51)mm,F=85.225,P0.05;LVESD:(6.61±0.35)mm,(7.02±0.26)mm,(8.20±0.49)mm,F=37.697,P0.05]。9相关性分析结果:LVEF与心肌细胞的凋亡率呈负相关(r=-0.769,P0.01,Y=76.091-0.36X);与毛细血管密度及VEGF m RNA的表达量呈正相关(r=0.85,P0.01,Y=47.726+0.776X;r=0.741,P0.01,Y=47.484+11.047X)。结论:经Bcl-2基因修饰的BMSCs移植可较单纯BMSCs移植更显著地减少心肌细胞凋亡、促进血管新生、改善心功能,其作用机制可能与Bcl-2基因的抗凋亡作用及BMSCs旁分泌作用下微循环的改善有关。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R457.7

【参考文献】