【摘要】：喹诺酮类药物是目前应用非常广泛的广谱抗生素之一,细菌对该类药物的耐药性备受关注。介导喹诺酮类药物耐药的机制包括染色体基因突变和质粒介导的喹诺酮耐药。其中,qnr基因是近年来的研究热点,qnr基因型包括qnr A、qnr B、qnr C、qnr S,本地区以qnr B型多见。qnr B存在于ISCR1(Insertion Sequence Common Regions 1,插入序列共同区1)可变区内,与ISCR1相连介导耐药传播。而ISCR1通常与I类整合子结合,组成复合性I类整合子。由于同时含有I类整合子和ISCR1两种基因转移元件,因此,复合性I类整合子具有对耐药基因更强大的传播能力。对整合子、qnr基因等的检测,以往的方法主要有:PCR-RFLP、脉冲凝胶电泳技术、Southern Blot技术等,这些方法繁琐,耗时耗力,因此建立一种快速简便的检测Int I-ISCR1-qnr B的方法十分必要。鉴于此,本研究通过调查研究199例临床分离株,首先建立一种可快速检测I类整合子、ISCR1和喹诺酮耐药基因qnr B的Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评价。在此基础上,利用所建立的Int I-ISCR1-qnr B方法检测临床分离株,通过与药敏试验方法比较,分析方法的临床应用价值,为喹诺酮类耐药提供临床预警信息。方法1.菌株来源:199例革兰阴性杆菌菌株分离自2014年11月9日至2014年5月5日期间某院临床各科室送检标本。2.微生物鉴定和药敏系统对所有临床分离株进行鉴定和药敏分析。3.采用Primer Premier5.0软件,以I类整合酶基因、ISCR1保守区orf513、qnr B基因保守区为靶区分别设计特异性的引物,构建Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法反应体系。4.梯度PCR法确定Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法的最适退火温度。5.Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法同时检测I类整合子、ISCR1、qnr B耐药基因,琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物,以Image J软件扫描电泳条带灰度值,对目的基因进行半定量分析。6.Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法检测80例临床分离菌株,并对PCR产物进行测序,评价建立的Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法的特异性。7.麦氏比浊法检测细菌浓度,将细菌原始浓度稀释成108cfu/ml,并依次倍比稀释为107、106、105、104、103、102、101cfu/ml,用Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法进行扩增,分析该方法的灵敏度。8.以Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法检测119例临床分离株,并与药敏试验结果比较。9.采用SPSS 17.0软件进行数据统计学分析,两种方法之间的差异比较用?2检验,α=0.05。结果1.梯度PCR法确定Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法的最适退火温度为57.5℃。2.Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法同时检测到I类整合子、ISCR1、qnr B三个基因,产物分别是280bp、475bp、607bp,与目标靶序列一致。3.Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法检测80例临床分离菌株,Int I-ISCR1-qnr B阳性19例,平均OD值分别为Int I 217.9±33.3,ISCR1 243.2±60.6,qnr B203.7±59.4.Int I-ISCR1-qnr B阴性61例。测序分析Int I-ISCR1-qnr B阳性的为19例,符合率100%,测序结果经Blast证实与Gene Bank公布序列一致,序列号分别是:HQ018645.1,KM111273.1,NG036203.1。4.Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法灵敏度为101cfu/ml。5.Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法检测119例临床分离菌株Int I-ISCR1-qnr B基因,Int I-ISCR1-qnr B阳性35例,Int I-ISCR1-qnr B阴性84例。药敏试验喹诺酮耐药92例,敏感及中介27例。经统计学分析检测?2=3.36?2(0.05,1)=3.84,P0.05,所建立的Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法与药敏试验相比差异无统计学意义。结论1.成功建立了能够一次PCR同时检测I类整合子、ISCR1、qnr B耐药基因三个靶标的Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法,该方法灵敏、快速、特异性强。2.所建立的Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法检测qnr B基因与药敏检测结果相符合。3.Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法检测Int I-ISCR1-qnr B基因可为临床喹诺酮耐药提供预警信息。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R440
【参考文献】
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