β-catenin转染表皮干细胞对糖尿病大鼠创面修复的影响

发布时间：2017-03-16 22:00

  本文关键词：β-catenin转染表皮干细胞对糖尿病大鼠创面修复的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 探讨体外培养条件下不同葡萄糖浓度对大鼠表皮干细胞（epidermal stemcells，ESCs）生长的影响，以及上调β-catenin的表达对糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）大鼠表皮干细胞增殖分化的作用，观察上调糖尿病大鼠表皮干细胞中β-catenin的表达对创面愈合的影响，，为临床糖尿病创面的修复治疗奠定实验基础。 方法： （1）取SD大鼠背部皮肤,采用酶消化法分离表皮和真皮，Ⅳ型胶原差速贴壁法纯化表皮干细胞，建立体外培养大鼠表皮干细胞模型，随机分成A组(对照组，葡萄糖浓度5.5mmol/L)，B组(葡萄糖浓度10mmol/L)，C组(葡萄糖浓度20mmol/L)，D组（葡萄糖浓度40mmol/L）。显微镜下观察表皮干细胞的生长情况，免疫细胞化学法检测表皮干细胞中β-catenin、Wnt1的表达，使用图像分析软件测量阳性细胞表达的平均积分光密度值。 （2）制备糖尿病大鼠模型(腹腔一次性注射链脲佐菌素STZ，剂量为65mg/kg)，体外分离培养糖尿病大鼠表皮干细胞（ESCs），采用脂质体介导法将pcDNA3.1myc-β-catenin质粒转入ESCs，同时设立脂质体对照组(转脂质体)和正常对照组，48h后，免疫细胞化学法检测各组表皮干细胞中β-catenin的表达；Western Blot检测转染组与正常对照组表皮干细胞中β-catenin、Wnt1、CyclinD1的表达情况。 （3）选取成模的DM大鼠15只，分别在脊柱两侧的背部制备直径约2.0cm的全层皮肤缺损创面，即每只大鼠制备四个创面，并随机分为4组：A组(创面移植羊膜负载转染的表皮干细胞组)，B组(创面移植羊膜负载未转染表皮干细胞组)，C组(羊膜组)和D组(空白对照组,不加任何干预)。观察创面愈合情况并测算创面愈合率，采用HE染色进行组织病理学观察以及免疫组织化学法检测创面组织中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达。 结果： （1）显微镜下观察，随着葡萄糖浓度的升高，细胞数量逐渐减少，生长速度缓慢，胞体透亮度下降，活力降低；免疫细胞化学染色分析结果显示，C组β-catenin(0.079±0.007）、Wnt1（0.083±0.004）和D组β-catenin（0.068±0.008）、Wnt1（0.070±0.006）的表达均明显低于A组（β-catenin：0.096±0.123；Wnt1：0.095±0.010），p0.01。 （2）免疫细胞化学结果显示,表皮干细胞转染重组质粒后β-catenin的表达增高，其表达水平高于脂质体组和空白对照组(p0.01)，脂质体组和空白对照组组间差异无统计学意义（p0.05）。Western Blot检测结果显示,转染组β-catenin、Wnt1、CyclinD1的表达均高于空白对照组(1.451±0.027vs1.094±0.026；1.084±0.078vs0.694±0.082；1.490±0.030vs0.807±0.019，p0.01）。 （3）A组创面与B、C、D组相比较，其愈合时间缩短且创面愈合率提高，组间比较差异有统计学意义(P0.01)，各组创面组织中均可见PCNA阳性细胞表达，A组的阳性细胞表达高于其他三组。 结论： （1）本实验条件下高浓度葡萄糖对体外培养大鼠表皮干细胞的生长有抑制作用,且表皮干细胞中β-catenin、Wnt1的表达减弱。 （2）采用脂质体转染法可成功将pcDNA3.1myc-β-catenin重组真核表达质粒转入体外培养的糖尿病大鼠表皮干细胞；转染细胞β-catenin的表达增高，并伴有Wnt1、CyclinD1的表达提高。 （3）上调糖尿病大鼠表皮干细胞中β-catenin的表达可以促进糖尿病创面的愈合。
【关键词】：糖尿病 表皮干细胞 转染 增殖分化 创面修复
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R473.5
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第1章 引言11-14
• 第2章 材料和方法14-22
• 2.1 材料14-15
• 2.1.1 实验动物14
• 2.1.2 主要试剂14-15
• 2.1.3 主要仪器15
• 2.2 实验方法15-21
• 2.2.1 表皮干细胞的分离培养15-16
• 2.2.2 表皮干细胞的鉴定16-17
• 2.2.3 不同糖浓度培养后细胞免疫化学检测17
• 2.2.4 糖尿病大鼠模型建立17
• 2.2.5 质粒转化与提取17
• 2.2.6 细胞分组17-18
• 2.2.7 Western Blot 检测转染效果及 ESCs 中β-catenin、Wnt1、CyclinD1的表达18-19
• 2.2.8 羊膜的制备及负载19-20
• 2.2.9 实验动物分组20
• 2.2.10 创面观察及创面愈合率计算20
• 2.2.11 组织病理学观察20-21
• 2.3 统计学处理21-22
• 第3章 结果22-28
• 3.1 表皮干细胞的鉴定22
• 3.2 不同葡萄糖浓度培养后表皮干细胞形态学观察结果22-23
• 3.3 不同葡萄糖浓度培养后表皮干细胞β-catenin、Wnt1 的表达23-24
• 3.4 质粒鉴定24-25
• 3.5 免疫细胞化学染色检测β-catenin 的表达25
• 3.6 转染组和对照组β-catenin、Wnt1、CyclinD1 蛋白的表达25-26
• 3.7 创面愈合情况26-27
• 3.8 组织学观察27-28
• 第4章 讨论28-32
• 4.1 糖浓度对体外培养表皮干细胞的影响28-29
• 4.2 上调β-catenin 的表达对糖尿病大鼠表皮干细胞增殖分化的影响29-30
• 4.3 上调 ESCs 中β-catenin 的表达构建组织工程皮肤的可行性探讨30-32
• 第5章 结论及展望32-33
• 致谢33-34
• 参考文献34-37
• 攻读学位期间的研究成果37-38
• 综述38-46
• 参考文献43-46

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：252352