CRISPR/Cas9基因编辑技术建立S1PR5基因敲除小鼠

发布时间：2022-12-08 18:41

　　目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立S1PR5基因敲除的小鼠模型,为研究鞘氨醇-1-磷酸受体5（sphingosine-1-phosphate receptor 5,S1PR5）在异基因造血干细胞移植中的作用提供实验工具。方法:根据S1PR5基因第三外显子碱基序列,设计针对S1PR5基因的sgRNA（single guide RNA）,构建sgRNA表达质粒,利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9后,将Cas9 mRNA和sgRNA对C57BL/6小鼠的受精卵进行显微注射。使用T7E1酶切和或基因测序检测S1PR5基因碱基的突变情况,然后应用q PCR和Western blot方法检检测S1PR5是否被成功敲除。结果:获得了2种S1PR5基因突变的F2代纯合子小鼠,即基因分别缺失170 bp和215 bp的S1PR5-170/-170小鼠和S1PR5-215/-215小鼠。在这两种小鼠中,S1PR5在mRNA和蛋白水平均没有表达。结论:成功建立了S1PR5基因敲除的小鼠模型,为探讨S1PR5在异基因造血干细胞移植的作用提供了研究平台。 

【文章页数】：8 页

【文章目录】：
材料和方法
    质粒构建
    体外转录和Cas9 mRNA/sgRNA的显微注射
    小鼠基因组DNA提取,PCR扩增及T7E1酶切检测突变
    S1PR5表达的q PCR及Wstern blot检测
    S1PR5-/-小鼠NK细胞功能的流式细胞术检测
结果
    sgRNA的设计、打靶载体构建及受精卵显微注射
    PCR和测序验证F0代首建鼠
    PCR和测序验证F1代小鼠
    F2代纯合子小鼠的验证
    F2代纯合子小鼠NK细胞的功能
讨论



本文编号：3713916