辽宁海域大菱鲆病原微生物的调查及快速检测方法的建立

发布时间：2017-07-20 18:08

  本文关键词：辽宁海域大菱鲆病原微生物的调查及快速检测方法的建立

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【摘要】：近年来大菱鲆凭借其生长快、肉质鲜美、商品价值高等诸多优点,成为辽宁沿海地区热门养殖品种。以葫芦岛地区为代表,形成了标志性的大菱鲆养殖产业基地,其大菱鲆养殖面积达150万平方米,产值15亿元,养殖产量为2.5万吨,约占全国大菱鲆养殖产量的58%。然而伴随着养殖规模的迅速扩大,产业发展速度明显超越了病害防治速度,根据辽宁省水产技术推广总站的数据,近年来辽宁省工厂化养殖大菱鲆病害损失严重,平均每个月损失金额高达3万元，占所有水产养殖品种经济损失总数的98%。在养殖过程中水温低时,大菱鲆摄食量减少,体质变弱,就会引起细菌性疾病的爆发,此类疾病一旦爆发后便难以控制,必定会为养殖户带来难以估量的损失。由于对辽宁海域大菱鲆养殖过程中常见致病菌的研究相对匮乏,加之相关病原微生物的快速检测方法存在空白,导致辽宁省大菱鲆养殖业的发展受到了限制。为了解决以上问题,我们针对辽宁海域大菱鲆病原微生物进行了系统的调查,并根据调查结果针对相关重要病原微生物建立起快速检测方法,主要方法为PCR检测,具体内容包括引物的设计,及其特异性和灵敏性的验证。该研究对辽宁省主要的大菱鲆养殖基地进行了病原样本采集,并对样本病灶部位的菌群进行了传统的分离、纯化和鉴定以及16S rRNA宏基因组测序分析。研究结果表明：大菱鲆病灶部位的优势菌群主要有弧菌(Vibrio)和气单胞菌(Aeromonas)等,其中溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、灿烂弧菌(Vibro Splendidus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)等与大菱鲆疾病的诱发有着密切关联,严重威胁了该养殖产业的健康发展。鉴于该领域对弧菌的研究比较完善而对气单胞菌的研究相对匮乏,本论文以嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)和温和气单胞菌(Aeromonas sobria)为主要研究对象,设计了12对特异性引物,且对各引物进行了特异性和灵敏性验证,其结果显示嗜水气单胞菌引物H-2、杀鲑气单胞菌引物Sa-1, Sa-2, Sa-3、温和气单胞菌引物So-1, So-2, So-3以及舒伯特气单胞菌引物Sc-1,均有很强的特异性和灵敏性,可用于检出单个病原菌株快速检测方法的建立,与此同时利用引物H-2、So-3以及Sc-1建立可同时检出3种致病菌株的多重引物PCR检测方法,经验证该检测方法特异性强、灵敏度高。本研究为大菱鲆养殖过程中高发致病菌的检测和分析提供了必要的理论依据和完善的方法体系,不仅为今后大菱鲆养殖产业的健康发展做出了贡献,同时为其他水产品中病原微生物的检测提供了指导,为促进我国水产品养殖产业的规模化健康发展奠定了基础。
【关键词】：辽宁海域 大菱鲆 气单胞菌 多重引物PCR
【学位授予单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S943
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 引言12-20
• 0.1 大菱鲆养殖概况12-13
• 0.2 大菱鲆养殖中常用疾病检测技术13-17
• 0.2.1 聚合酶链反应方法13-15
• 0.2.2 其他常见检测技术15-17
• 0.3 常见致病菌的特异性基因17-19
• 0.3.1 dnaJ基因17-18
• 0.3.2 其他常见特异性基因18-19
• 0.4 研究目的及意义19-20
• 第1章 辽宁海域大菱鲆养殖病原微生物调查20-39
• 1.1 调查场地20-21
• 1.2 调查过程与方法21-23
• 1.2.1 实验材料21
• 1.2.2 实验器材21
• 1.2.3 实验方法21-23
• 1.3 调查结果与分析23-38
• 1.3.1 大菱鲆普遍病症调查结果23-26
• 1.3.2 常见致病菌调查结果26-38
• 1.4 小结38-39
• 第2章 主要病原细菌快速检测方法的建立39-63
• 2.1 材料与方法39-45
• 2.1.1 实验材料39-40
• 2.1.2 实验方法40-45
• 2.2 结果与分析45-61
• 2.2.1 基因的选择45-46
• 2.2.2 目的菌株特异性引物设计结果46-48
• 2.2.3 引物特异性验证48-57
• 2.2.4 引物灵敏性验证57-60
• 2.2.5 多重PCR条件的优化60-61
• 2.2.6 三重PCR灵敏性验证61
• 2.3 小结61-63
• 第3章 结论与展望63-65
• 3.1 结论63
• 3.2 展望63-65
• 致谢65-66
• 参考文献66-69
• 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况69

【参考文献】

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本文编号：569298