跑台训练对大鼠跟腱的影响及相关机制研究

发布时间：2018-01-04 07:38

本文关键词：跑台训练对大鼠跟腱的影响及相关机制研究　出处：《南方医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肌腱为致密的纤维结缔组织,是运动系统的重要组成部分。它连接肌肉和骨骼,传导肌肉的收缩力(主要是张应力)到骨骼,从而带动关节的运动或保持肢体的平衡。在运动过程中,肌肉产生的收缩力越大、肌腱所承受的应力也就越大。长期、反复地过度使用会导致肌腱病。而肌腱内缺乏血管,细胞较少,代谢活性相对要低,一旦损伤,再生、修复能力有限,导致炎症、退变等,甚至断裂,严重影响人们的生活质量和运动能力。因此,肌腱病受到医学界广泛的关注。肌腱病是骨科学、运动医学、康复医学和老年医学的常见病。好发于跑、跳运动员以及肌腱过度劳损的人,发病率约为2-65%,占所有运动相关疾病的30～50%。在我国,随着经济的发展,人们生活水平的提高,越来越多的人参与到体育运动中来；但是,由于运动方式不恰当、意外事故发生以及人口老龄化,肌腱运动性损伤的发病率也逐年升高。与此同时,人们生活方式也发生了巨大的转变,例如长期用键盘打字以及手机使用的普及等导致手部的肌腱损伤。肌腱病已逐渐成为影响人们生活质量和运动能力的主要疾病之一。尤其是对于喜好运动的人来说,肌腱病的发生往往会严重影响其运动能力,甚至无法重返运动场。因此,一直以来,肌腱病的预防和治疗都是国内外医学界普遍关注和迫切需要解决的问题。关于肌腱病的治疗方法有很多,总的可以分为保守治疗和手术治疗。保守治疗包括休息、改变运动方式、物理治疗、康复训练、口服非甾体类抗炎药(NSAIDs)和局部注射治疗等等。但是,大多数保守治疗往往只能暂时缓解症状,长期疗效欠佳。而手术治疗又常常引起肌腱粘连、纤维性疤痕形成,愈后的肌腱也在生物力学性能、化学组成以及结构等方面都明显低于正常肌腱组织,容易再次断裂。产生这些问题的根本原因在于肌腱病的发病机制尚未明确,当前的治疗多是基于单纯的理论分析和有限的临床经验,而不是针对生理病理学机制。因此,要寻求更有效、更具针对性的预防和治疗方法,必须首先阐明肌腱病的发病机制。目前,关于肌腱病的发病机制有很多假说和理论,包括肌腱退变变性假说,炎症假说,干细胞异常分化假说,微损伤假说,力学-生物学偶联假说,缺血-再灌注假说等等。尽管这些假说和理论都具有一定的科学性,但其中任何一种都无法完全、真正的阐述肌腱病的发病机制。因此,探讨肌腱病的发病机制不应拘泥于以上任何一种学说,而应从细胞学和分子生物学角度,结合各种假说和理论中有价值的科学论据综合考虑。运动时,肌腱传导应力。反过来,在应力作用下,肌腱像其它活的、有生命的组织一样,也有重塑自身的能力。通过改变生物力学性能、结构和化学组织等来适应或抵抗新的力学环境。训练是观察肌腱重塑过程的重要方法。总的来说：合理的训练能改善肌腱的结构,增加胶原合成,提高生物力学性能,促进微损伤的修复；然而,不合理的训练往往会破坏肌腱的结构,增加胶原降解,降低生物力学性能,造成修复失败,肌腱损伤,甚至断裂。以往的研究由于选择的研究对象,性别,年龄,训练方式、时间、频率、强度不同,研究结果往往差异很大。考虑到肌腱病最常见的病因是长期、反复地过度使用,本课题将探讨运动强度对肌腱的影响。我们通过跑台跑步模型设置三种不同的训练强度,与自由活动比较,观察肌腱组织在重塑过程中的生理、病理变化,从而进一步探讨肌腱病的发病机制,以期为临床肌腱病的预防和治疗提供实验依据。本课题包括三个部分：第一部分将观察不同强度跑台训练对大鼠跟腱结构和生物力学特性的影响；第二部分将探讨不同强度跑台训练对大鼠跟腱内生物化学组成的影响；第三部分将探讨不同强度跑台训练对大鼠跟腱内肌腱干细胞增殖和分化的影响。第—部分不同强度跑台训练对大鼠跟腱结构和生物力学特性的影响目的1.观察不同强度跑台训练对大鼠跟腱生物力学特性的影响；2.观察不同强度跑台训练对大鼠跟腱结构的影响。材料与方法1、实验动物和训练方案24只8周龄、雄性、200-250g SD大鼠随机分成四组,对照组(CON)、低强度训练组(LIR)、中强度训练组(MIR)和高强度训练组(HIR)。3个训练组进行8周强度不同的跑台训练。2、标本取材各组大鼠在训练组最后一次训练24小时后被处死,处死前称量其体重。在无菌条件下切取大鼠双侧后肢跟腱,测量跟腱横截面积。每只大鼠任意取一侧跟腱用于组织学观察。取另一侧跟腱用于生物力学检测。3、检测指标8周跑台训练前、后的体重变化情况；8周跑台训练后跟腱横截面积；生物力学特性检测；透射电镜检测跟腱内胶原纤维平均直径；苏木素-伊红染色；天狼猩红染色后透射电镜观察跟腱内胶原纤维排列。4、统计学分析结果均采用均数±标准差表示,数据用SPSS16.0 (Chicago, IL, USA)统计软件包处理,单因素方差分析和T检验；P≤0.05认为差异有统计学意义。结果8周跑台训练前、后各组大鼠体重差异无统计学意义(P0.05)。8周跑台训练后各组大鼠跟腱横截面积差异无统计学意义(P0.05)。LIR组跟腱力学特性无影响(P0.05),MIR组跟腱刚度、最大载荷和弹性模量增加(P0.05),HIR组生物力学性能下降(P0.05)。LIR组跟腱内胶原纤维平均直径无变化(P0.05),MIR组胶原纤维平均直径显著增粗(P0.05),HIR组胶原纤维平均直径显著变细(P0.05)。苏木素-伊红染色光镜下观察结果显示：CON组：胶原纤维沿肌腱长轴相互平行排列,有轻微的波纹；细胞位于胶原纤维之间,均匀散布,核清晰,呈椭圆形。LIR组：胶原纤维平行排列,波纹消失；细胞散布胶原原纤维之间。MIR组：胶原纤维排列平行、整齐、规则、紧密；细胞数量稍增多。HIR组：胶原纤维排列紊乱、松散；细胞分布不均,局部见数量增多、密集分布,形态异常。天狼猩红染色后透射电镜观察显示：CON组以鲜红色的Ⅰ型胶原纤维为主,纤维平行排列,可见少许细小的呈绿色折光的Ⅲ型胶原纤维;LIR组以Ⅰ型胶原纤维为主,可见少许细小的绿色的Ⅲ型胶原纤维,纤维排列整齐,类似于对照组；MIR组纤维排列整齐、紧密,主要为鲜红色的Ⅰ型胶原纤维,无或有极少量绿色的Ⅲ型胶原纤维；HIR组Ⅰ型胶原纤维虽然较Ⅲ型相对为多,但纤维排列紊乱,纵横交错。结论本部分实验结果说明：不同强度跑台训练能对大鼠跟腱生物力学特性和结构产生不同的影响。低强度跑台训练没有改变大鼠跟腱生物力学特性和结构。中强度跑台训练能使胶原纤维直径增粗,排列更加规则、紧密,改善肌腱生物力学性能。而高强度跑台训练使胶原纤维直径变细,排列紊乱,降低肌腱生物力学性能。第二部分不同强度跑台训练对大鼠跟腱内生物化学组成的影响目的1.探讨不同强度跑台训练对大鼠跟腱内胶原含量的影响；2.探讨不同强度跑台训练对大鼠跟腱内MMP-13、TIMP-1表达的影响；3.探讨不同强度跑台训练对大鼠跟腱内decorin、biglycan、aggrecan表达的影响。材料与方法1、实验动物和训练方案同第一部分。2、标本取材各组大鼠在训练组最后一次训练24小时后被处死。在无菌条件下切取大鼠双侧后肢跟腱。每只大鼠任意取一侧跟腱,浸入10%中性福尔马林溶液中固定,用于组织学检测。取另一侧跟腱,放入-80℃液氮中,用于蛋白含量及基因表达检测。3、检测指标免疫组化检测训练后跟腱组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原.decorin的表达；ELISA测定训练后跟腱组织中MMP-13、TIMP-1 蛋白含量； qPCR测定训练后跟腱组织中Ⅰ型胶原nRNA,III型胶原mRNA,decorin mRNA,biglycan mRNA,aggrecan mRNA表达。4、统计学分析结果均采用均数±标准差表示,数据用SPSS16.0(Chicago,IL,USA)统计软件包处理,单因素方差分析和T检验；P-0.05认为差异有统计学意义。结果免疫组化检测结果显示：LIR组跟腱内Ⅰ型胶原含量无变化(P0.05):MIR组跟腱内Ⅰ型胶原含量显著增加(P0.05):HIR组跟腱内Ⅰ型胶原含量显著减少(P0.05).LIR组和MIR组跟腱内Ⅲ型胶原含量无变化(P0.05):HIR组跟腱内Ⅲ型胶原含量显著增加(P0.05).LIR组跟腱内decorin含量无变化(P0.05):MIR组跟腱内decorin含量显著增加:P0.05):HIR组跟腱内decorin含量显著减少(P0.05)。ELISA检测结果显示：LIR组跟腱内MMP-13含量无变化(P0.05); MIR组跟腱内MMP-13含量显著增加(P0.05); HIR组跟腱内MMP-13含量进一步增加(P0.05)。LIR组跟腱内TIMP-1含量无变化(P0.05); MIR组跟腱内TIMP-1含量显著增加(P0.05)；HIR组跟腱内TIMP-1含量显著减少(P0.05)。qPCR检测结果显示：LIR组跟腱内Ⅰ型胶原mRNA表达无变化(P0.05)；MIR组跟腱内Ⅰ型胶原mRNA表达显著增加(P0.05)；HIR组跟腱内Ⅰ型胶原mRNA表达显著减少(P0.05)。LIR组和MIR组跟腱内Ⅲ型胶原mRNA表达无变化(P0.05);HIR组跟腱内Ⅲ型胶原mRNA表达显著增加(P0.05)。LIR组跟腱内decorin mRNA表达无变化(P0.05);MIR组跟腱内decorin mRNA表达显著增加(P0.05)；HIR组跟腱内decorin mRNA表达显著减少(P0.05)。LIR组跟腱内biglycan mRNA表达无变化(P0.05); MIR组跟腱内biglycan mRNA表达显著减少(P0.05)；HIR组跟腱内biglycan mRNA表达显著增加(P0.05)。LIR组、MIR组跟腱内aggrecan mRNA表达无变化(P0.05)；HIR组跟腱内aggrecan mRNA表达显著增加(P0.05)。结论本部分实验结果说明：不同强度跑台训练能对大鼠跟腱内生物化学组成产生不同的影响。低强度跑台训练没有改变大鼠跟腱生物化学组成。中强度跑台训练促使MMP-13和TIMP-1之间达到平衡,I型胶原合成增加；decorin增加使胶原原纤维有序形成。而高强度跑台训练打破了MMP-13和TIMP-1之间的平衡,Ⅰ型胶原被降解；decorin减少使胶原原纤维形成紊乱。第三部分不同强度跑台训练对大鼠跟腱内肌腱干细胞增殖和分化的影响目的1.探讨不同强度跑台训练对大鼠跟腱内肌腱干细胞增殖的的影响；2.探讨不同强度跑台训练对大鼠跟腱内肌腱干细胞分化的的影响。材料与方法1、实验动物和训练方案同第一部分。2、标本取材各组大鼠在训练组最后一次训练24小时后被处死。在无菌条件下切取大鼠双侧后肢跟腱。分离、培养肌腱干细胞。3、检测指标MTT法检测训练后各组跟腱组织中干细胞增殖能力；qPCR测定训练后各组跟腱组织中干细胞Ⅱ型胶原mRNA, Sox 9 mRNA, Runx 2 mRNA表达；Western Blotting测定训练后各组跟腱组织中干细胞BMP-2蛋白表达。4、统计学分析结果均采用均数±标准差表示,数据用SPSS 16.0 (Chicago, IL, USA)统计软件包处理,单因素方差分析和T检验；P≤0.05认为差异有统计学意义。结果MTT检测结果显示：CON组、LIR组和HIR组OD值之间无显著差异(P0.05),而MIR组显著增高(P0.05)。qPCR检测结果显示：CON组、LIR组和MIR组跟腱内Ⅱ型胶原mRNA和Sox 9 mRNA表达无显著差异(P0.05),而HIR组腱内Ⅱ型胶原mRNA和Sox9 mRNA表达显著增高(P0.05)。CON组、LIR组、MIR组和HIR组跟腱内Runx 2 mRNA表达无显著差异(P0.05)。Western Blotting检测结果显示：CON组、LIR组和M1R组跟腱内BMP-2蛋白表达无显著差异(P0.05),而HIR组腱内BMP-2蛋白表达显著增高(P0.05)。结论本部分实验结果说明：不同强度跑台训练能对大鼠跟腱内肌腱干细胞产生不同的影响。低强度跑台训练没有改变大鼠跟腱内肌腱干细胞的增殖和分化。中强度跑台训练促使肌腱干细胞增殖,并定向分化成肌腱细胞。而高强度跑台训练引起肌腱干细胞产生BMP-2,诱导肌腱干细胞错误分化成软骨细胞,因而decorin减少,biglycan和aggrecan增多。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R685

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