促甲状腺激素通过PKA通路抑制3T3-L1脂肪细胞中脂肪甘油三酯脂酶的表达

发布时间：2019-04-29 15:29

【摘要】：研究背景：随着经济的发展,生活水平的提高、环境和习惯的改变,我国乃至全球肥胖症患病人数逐渐增多,1980年以来,世界肥胖人数增长了近一倍,至2008年,20岁及以上的成年人中有超过14亿人超重,其中2亿多男性和近3亿女性为肥胖症患者,肥胖正威胁着越来越多的人的健康：超重和肥胖是全球引起死亡的第六大风险,许多疾病都与肥胖有着密切的关系：如糖尿病、高脂血症、高血压病、冠心病及某些肿瘤如乳腺癌、直肠癌等。肥胖及其所带来的健康问题为全球各个国家的经济增加了沉重的负担。在成人,肥胖的病理生理主要是指脂肪细胞体积的增大,即细胞内甘油三酯含量的增加,其原因包括甘油三酯合成的增加和/或者分解的减少。在本研究中,我们重点关注了脂肪细胞内甘油三酯的分解代谢(即脂解)。脂解是指甘油三酯逐步分解为游离脂肪酸和甘油的过程,这一过程受很多酶和因子的调控。曾经,人们认为激素敏感性脂肪酶(HSL)是甘油三酯分解过程中的唯一限速酶,直到脂肪甘油三酯脂酶(Adipose Triglyceride Lipase, ATGL)被人们发现。ATGL于2004年被发现,随后的研究发现,它是脂解过程中的一种重要的限速酶：ATGL负责将甘油三酯分解为甘油二酯和游离脂肪酸,启动了甘油三酯的分解过程。研究发现,ATGL在甘油三酯分解代谢的基础脂解以及肾上腺素等刺激后引起的脂解过程中可能都发挥着重要的作用,ATGL是脂解过程中的重要的限速酶。ATGL基因敲除后,小鼠出现多器官中甘油三酯堆积、以致严重影响了其心脏功能、引起小鼠早期死亡；在人体,ATGL基因突变后也可以引起器官中中性脂肪的堆积。亚临床甲状腺功能减退症(subclinical hypothyroidism, SCH),即我们简称的亚甲减,是指血液中促甲状腺激素(TSH)的水平高于正常、而游离甲状腺素即游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、血清游离甲状腺素(FT4)水平在正常参考值范围内,它可能是甲状腺功能减退的早期阶段。临床资料显示：亚临床甲状腺功能减退与高脂血症、肥胖等相关,TSH与体重正相关,这说明TSH可能参与调节体内的脂肪代谢。TSH是体内调控甲状腺功能的重要的蛋白分子,它由腺垂体分泌,在体内与促甲状腺激素受体(TSHR)结合后发挥其生理作用。近年来的研究证明,TSHR也在脂肪细胞上表达、具有一定的调节脂质代谢的功能：TSH可以促进前脂肪细胞向成熟的脂肪细胞分化,另有研究称TSH也可以促进甘油三酯分解,但目前,TSH对脂肪细胞内甘油三酯分解代谢过程中的限速酶之一的ATGL的表达有无影响尚未见报道,在本实验中,我们试图从体内、体外水平观察TSH能否影响ATGL的表达及其可能的分子机制。目的：1.脂肪细胞已经被证明可以表达功能性TSHR,本课题拟观察Tshr-/-小鼠附睾脂肪细胞中ATGL的表达；另外在体外实验中用TSH处理诱导分化成熟的脂肪细胞,观察TSH对ATGL表达的影响,通过体内实验及体外实验来探讨TSH在脂解过程中可能发挥的作用,揭示亚临床甲减致肥胖的可能分子机制。2、利用cAMP激动剂forskolin和PKA抑制剂H89及TSH分别处理诱导分化成熟的脂肪细胞,观察细胞中ATGL的表达,以此来观察cAMP/PKA通路是否参与了TSH对ATGL的作用、揭示其可能的作用机制。研究方法：1、细胞培养：按照培养方案将3T3-L1小鼠成纤维细胞通过诱导分化、培养成为成熟的脂肪细胞,在将细胞进行诱导分化的过程中,分别观察不同天数时细胞中ATGL的表达。并用0.1 u M、1 u M、2 μ M的bTSH分别处理分化成熟的脂肪细胞24小时及48小时,然后观察细胞中ATGL表达的变化。2、动物模型：Tshr-/-小鼠及Tshr+/+/小鼠饲养于屏障(SPF)环境中,按照白天与夜晚各12小时予以昼夜循环,饲料和水自由摄入。4-6周断乳后对雄性小鼠进行基因型鉴定,按照基因型鉴定结果将同窝雄性小鼠分为三组：Tshr+/+、Tshr+/-和Tshr-/-, Tshr-/-组小鼠予以外源性补充T4；Tshr-/-小鼠和Tshr+/+小鼠用于实验。3、利用油红0染色观察脂肪细胞内脂滴的情况。4、采用RT-PCR技术检测细胞中ATGL基因mRNA的表达。5、采用Western Blotting方法检测细胞中ATGL蛋白的表达。6、采用免疫荧光方法观察ATGL在脂肪细胞中的表达和分布。7、采用免疫组化方法观察ATGL在脂肪组织细胞中的表达及分布。8、采用SAS系统和SPSS17.0统计软件分析实验数据。计量资料采用x±s做描述,多组均数比较采用方差分析,方差不齐的采用Kruskal-Wallis秩和检验。结果：1小鼠Tshr基因敲除后附睾周围脂肪细胞内ATGL的表达明显增加我们应用免疫组化技术,观察了Tshr-/-小鼠和Tshr+/+小鼠附睾周围脂肪组织石蜡切片中脂肪细胞内ATGL的分布和表达。免疫组化结果显示：在小鼠附睾周围脂肪组织石蜡切片中,脂肪细胞中的脂滴呈空泡状,细胞核被脂滴挤到一边,紧贴细胞膜,ATGL呈棕黄色,分布于细胞质中,亦被脂滴挤到一边、紧贴细胞膜；与Tshr+/+小鼠相比,Tshr-/-小鼠脂肪组织石蜡切片中,脂肪细胞中ATGL表达增多。同时,我们用Western blotting方法和RT-PCR方法分贝检测了附睾脂肪组织中ATGL蛋白的表达和mRNA的表达。与Tshr+/+小鼠相比,Tsh-/-小鼠附睾脂肪细胞中ATGL的蛋白表达及RNA表达都明显增加,这些都提示TSH可能抑制脂肪细胞中ATGL的表达。2.TSH抑制成熟3T3-L1细胞中ATGL的表达2.1在3T3-L1细胞被诱导分化的过程中,细胞中的ATGL的蛋白表达逐渐增加。在3T3-L1前脂肪细胞中,ATGL的蛋白表达量很少,随着诱导分化过程中天数的增加,细胞中ATGL的蛋白量逐渐增加,至D16天,80%--90%的前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞,ATGL的蛋白表达量最高。2.2 TSH抑制成熟3T3-L1脂肪细胞中ATGL的表达我们分别用0.1 μM、1 μ M、2μ M bTSH处理成熟脂肪细胞24小时和48小时,发现与空白对照组相比,bTSH刺激后成熟脂肪细胞内ATGL表达明显减少：处理24小时后,0.1 μM、1 μM与2 μMbTSH处理组与对照组相比,细胞内ATGL蛋白含量分别减少了31.1%(p0.01)、57.3%(p0.01)和58.1%(p0.01)；处理48小时后,0.1μ M、1μ M与2μ MbTSH处理组与对照组相比,细胞内ATGL蛋白含量分别减少了45.1%(p0.01)、60.5%(p0.01)和77.1%(p0.01),差异均有统计学意义。bTSH对ATGL的这种抑制作用呈明显的剂量依赖性,尤其在细胞被bTSH处理48小时后,不同剂量组间的差异显著(皆p0.01)。但bTSH对ATGL的抑制作用在0.1μM和1 μM时并没有表现出显著的时间依赖性：0.1μM bTSH分别处理细胞24小时和48小时后,细胞内的ATGL的蛋白表达均减少,但两组ATGL减少的量之间的差异并不显著；同样,应用1 μMbTSH分别处理细胞24小时和48小时后,两组细胞内的ATGL的蛋白表达均减少,但两组ATGL减少的量之间的差异也并不显著。但是应用2μM bTSH分别处理细胞48小时后,细胞内ATGL蛋白表达的减少较处理24小时后ATGL表达的减少更显著(p0.01)。用2 μMbTSH处理成熟脂肪细胞48小时后,应用RT-PCR技术观察细胞中ATGL的mRNA含量变化,结果发现细胞中ATGL的mRNA的含量较空白对照组减少约70%,差异具有统计学意义(p0.01)。以上结果显示,bTSH可以抑制成熟脂肪细胞中ATGL的表达,这种作用呈剂量依赖性。3 TSH通过激活cAMP/PKA途径抑制ATGL的表达3.1 cAMP激动剂forskolin可以抑制成熟3T3-L1细胞中ATGL的表达3T3-L1细胞被诱导分化为成熟脂肪细胞后,分别用浓度为2.5uM和5uM的forskolin处理细胞24小时后,应用Western blotting方法检测细胞中ATGL的蛋白表达,结果发现,和对照组相比,2.5uM处理组细胞内ATGL蛋白含量减少了47%(p0.01),5uM处理组细胞内ATGL蛋白含量减少了52%(p0.01)。3.2 PKA抑制剂H89对于成熟3T3-L1细胞中ATGL的表达无明显影响将3T3-L1细胞诱导分化为成熟脂肪细胞后,分别用浓度为5uM和10uM的H89处理细胞24小时后,应用Western blotting方法检测细胞中ATGL的蛋白表达,结果发现,和对照组相比,两个处理组细胞内ATGL蛋白的含量几乎无变化(p0.05)。3.3 TSH通过激活cAMP/PKA途径抑制成熟脂肪细胞内ATGL的表达将3T3-L1细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞后,进行实验。先用10uM的H89预处理细胞1小时,然后加入2uM的bTSH;其它几皿的细胞,则分别单独加入2uM的bTSH、5uM的forskolin和10uM的H89,另外一皿细胞则作为空白对照组。细胞被处理24小时后,应用Western blotting方法和免疫荧光方法检测细胞中ATGL的表达。Western blotting结果显示：与对照组相比,bTSH处理细胞组及forskolin处理细胞组细胞内ATGL的表达均明显受到抑制(p0.01,p0.01)；H89处理细胞组,脂肪细胞内ATGL的蛋白含量无明显变化；同样,用H89预处理后再用bTSH处理的细胞组,细胞内ATGL的蛋白含量较对照组也没有明显变化。免疫荧光结果与Western blotting结果一致,免疫荧光结果显示：ATGL表现为红色荧光,位于成熟脂肪细胞的细胞浆内,与对照组相比,bTSH及forskolin处理组细胞内ATGL的荧光亮度明显减弱,H89处理组ATGL的荧光亮度较对照组相比无明显变化,同样,用H89预处理后再用bTSH处理的细胞组,细胞内ATGL的荧光亮度较对照组也没有显著变化。综合上述结果说明,forskolin可以增加细胞内cAMP含量、激活PKA,从而可以抑制ATGL的表达；而当先利用H89将PKA的活性抑制后,再用TSH处理细胞,TSH与TSHR结合后无法活化PKA,从而无法发挥TSH对ATGL的抑制作用。结论：1、TSH对脂肪细胞中甘油三酯的分解代谢具有调节作用。2、TSH可以抑制小鼠成熟脂肪细胞中ATGL的表达。3、TSH通过激活cAMP/PKA通路来发挥抑制ATGL表达的作用。意义：亚临床甲减的患病人数逐渐增加,它与许多疾病相关,但对其的诊断和治疗都缺乏有力的证据；本研究丰富了TSH的甲状腺外作用的内容,指出了其在甘油三酯代谢中发挥的部分作用,为临床工作提供了新的思路。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R589.2

【引证文献】