煤炭瓦斯生物治理菌种的选育、分子鉴定及优化试验研究

发布时间：2017-10-13 11:27

  本文关键词：煤炭瓦斯生物治理菌种的选育、分子鉴定及优化试验研究

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【摘要】：瓦斯是指从煤岩中放出的有毒、有害气体的总称。长期以来煤矿瓦斯治理和灾害防治一直是困扰煤矿安全生产的世界性难题,至今仍没有很好的从根本上解决这一问题的办法。同时煤所具有的吸附和储存瓦斯的性能也给原煤的储存带来了极大的安全隐患。利用微生物的方法来治理煤矿瓦斯是一种十分有意义的新途径。本文对微生物降解瓦斯进行了初步的试验研究和探索。 本论文选取煤样和煤矿附近土壤样品,利用甲烷氧化菌选择培养基通过往密封血清瓶中置换入甲烷气体的方式,分离出了能够以甲烷为唯一碳源的甲烷氧化菌。在经过菌株的增殖培养、初筛、复筛、平板划线分离后得到一株能够高效降解甲烷的甲烷氧化菌株M-1。对所得菌株进行菌落形态及细胞形态的观察发现M-1菌落光滑、致密为圆形,细胞较小呈短杆状,为革兰阴(G-)性菌。初代培养时吸光度在48h后即可达到最大值(OD600=0.246),甲烷氧化利用率在96h时达到最大值68.26%。通过对菌株进行16S rDNA基因测序、比对、构建16S rDNA基因系统发育树后可以确定分离得到的菌株为一株能够降解甲烷的假单胞菌属(Pseudomonas)。 通过单因素试验发现甲烷氧化菌M-1的最适生长pH为6.5,最适生长温度为35℃,最佳氮源为KNO3。甲烷氧化菌M-1不仅能够利用甲烷作为碳源,而且能够利用葡萄糖、淀粉、甲醇、蛋白胨等碳源生长。响应面优化得到M-1的最佳培养基配方为Na2HPO40.30g/L, KH2PO40.28g/L, MgSO4·7H2O1g/L, KNO31g/L, CaCl20.08g/L,微量元素液1为587.18μL,微量元素液2为3080.30μL时,通过Design Expert软件预测最大响应值OD600为0.296。以此模型为最优条件配制培养基培养甲烷氧化菌48h得到OD600为0.293,与预测得到的值基本接近。利用上述最优培养基进行正交试验分析得到在培养温度35℃,初始pH=7,接种量3%,注入12mlCH4时预测均值达(甲烷氧化率)94.68%。对正交试验结果进行验证试验得到甲烷氧化率实际值达到92.60%,与正交试验预测结果相一致。通过测试M-1在混合气体条件下甲烷氧化试验得到在此条件下的甲烷降解率为64.26%,混合气体由之前的在爆炸范围内(甲烷含量6.8%)降解到甲烷含量为2.43%的安全范围。
【关键词】：瓦斯 甲烷氧化菌 假单胞菌属 响应面
【学位授予单位】：安徽理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：TD712
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-14
• 1 绪论14-23
• 1.1 煤矿瓦斯14-15
• 1.1.1 瓦斯的生成及其性质14-15
• 1.1.2 煤层瓦斯的赋存及吸附特性15
• 1.2 瓦斯灾害防治及存在问题15-17
• 1.2.1 煤矿瓦斯的危害15
• 1.2.2 瓦斯爆炸现有防治措施15-16
• 1.2.3 存在问题16
• 1.2.4 煤矿瓦斯治理的新技术和新方法16-17
• 1.3 微生物治理煤矿瓦斯概述17-20
• 1.3.1 利用瓦斯的微生物及其分布17-18
• 1.3.2 微生物降解瓦斯机理18-19
• 1.3.3 甲烷单加氧酶的分子生物学19-20
• 1.4 国内外微生物治理煤矿瓦斯的研究现状及存在问题20-21
• 1.4.1 国内外微生物治理煤矿瓦斯的研究现状20
• 1.4.2 微生物治理煤矿瓦斯存在问题20-21
• 1.5 本论文主要内容、技术关键及研究路线21-23
• 1.5.1 主要研究内容21-22
• 1.5.2 拟解决的问题22
• 1.5.3 研究路线22-23
• 2 材料、主要设备及研究方法23-29
• 2.1 试验研究的主要试剂和设备23-24
• 2.1.1 主要试剂23-24
• 2.1.2 主要仪器及设备24
• 2.2 菌种与培养基24-25
• 2.2.1 菌株的来源24
• 2.2.2 甲烷氧化菌培养基24-25
• 2.3 试验研究方法25
• 2.3.1 含甲烷氧化菌样品的富集培养25
• 2.3.2 甲烷氧化菌群的筛选25
• 2.4 甲烷氧化菌生理生化特性25-29
• 2.4.1 菌株的形态观察25-26
• 2.4.2 生理生化特征试验26-28
• 2.4.3 甲烷氧化菌生长量的测定28
• 2.4.4 甲烷氧化菌降解甲烷性能的测定28
• 2.4.5 试验数据的科学分析方法28-29
• 3 甲烷氧化菌的纯化及分子生物学鉴定试验29-44
• 3.1 菌种来源29
• 3.2 试验材料29
• 3.2.1 试验试剂和仪器29
• 3.2.2 培养基29
• 3.3 甲烷氧化菌的培养与纯化29-31
• 3.4 菌株形态观察与生理生化鉴定31-35
• 3.4.1 菌落观察31-32
• 3.4.2 扫描电子显微镜(scanning electron microscopy)32-33
• 3.4.3 甲烷氧化菌的生理生化33-34
• 3.4.4 甲烷氧化菌M-1生长量测定34-35
• 3.4.5 甲烷氧化菌降解甲烷性能的测定35
• 3.5 甲烷氧化菌M-1基因测序35-39
• 3.5.1 基因组DNA的提取35-36
• 3.5.2 16S rDNA PCR扩增电泳检测36-38
• 3.5.3 扩增16S rDNA全序列38-39
• 3.6 甲烷氧化菌M-1系统发育树的构建39-43
• 3.7 本章小结43-44
• 4 甲烷氧化菌高密度培养响应面优化试验44-60
• 4.1 菌种来源44
• 4.2 试验材料44
• 4.2.1 试验试剂和仪器44
• 4.2.2 培养基44
• 4.3 甲烷氧化菌M-1单因素优化试验44-48
• 4.3.1 甲烷氧化菌的活化与增殖44
• 4.3.2 单因素优化试验44-48
• 4.4 响应面优化培养基试验设计48-50
• 4.4.1 Plackett-Burman(PB)实验设计48-49
• 4.4.2 最陡爬坡实验49
• 4.4.3 响应面分析49-50
• 4.5 响应面优化培养基试验结果50-59
• 4.5.1 Plackett-Burman(PB)实验设计及结果50-53
• 4.5.2 最陡爬坡实验设计结果53
• 4.5.3 Box-Behnken实验结果分析53-56
• 4.5.4 响应面最优值与实验验证56-59
• 4.6 本章小结59-60
• 5 微生物治理瓦斯性能试验研究60-77
• 5.1 菌种来源60
• 5.2 试验材料60-61
• 5.2.1 试验试剂和仪器60
• 5.2.2 培养基60-61
• 5.3 甲烷氧化菌M-1利用瓦斯性能优化试验61-69
• 5.3.1 气相色谱分析61
• 5.3.2 气体GC分析条件及测定方法61-63
• 5.3.3 甲烷氧化菌M-1降解甲烷正交优化试验63-65
• 5.3.4 试验方法、步骤及试验结果65-69
• 5.4 试验结果分析与最优水平预测69-76
• 5.4.1 直观分析70-72
• 5.4.2 最优结果预测分析72-74
• 5.4.3 混合气体条件下甲烷氧化试验74-76
• 5.5 本章小结76-77
• 结论与展望77-79
• 参考文献79-82
• 致谢82-83
• 作者简介及读研期间主要科研成果83

【共引文献】

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本文编号：1024609