甲烷氧化菌的分离鉴定及在煤表面吸附特性研究

发布时间：2020-07-19 15:56

【摘要】：煤矿瓦斯是制约煤矿安全生产的重要因素。瓦斯的生物治理是利用甲烷氧化菌将煤矿瓦斯消解的新方法。本文从淮南张集煤矿的矿井水中富集筛选出甲烷氧化菌,研究其群落组成并从中分离纯化出甲烷氧化菌株,研究了不同培养条件对甲烷氧化菌在煤表面的吸附影响,菌株在煤表面的吸附规律以及吸附后煤的表面性质变化,得到主要结论如下:(1)富集得到的甲烷氧化菌混合菌群在门水平以变形菌门为主,占93.44%;在属水平上以甲烷氧化菌为主,占75.85%。采用平板分离法从混合菌群中分离得到甲烷氧化菌株HNM1,16S rDNA测序比对表明该菌为为嗜甲基菌属Methylophilus,该菌为短杆状,直径为0.5-1μm,长度2μm左右,以甲烷作为能源底物生长时6 d内甲烷氧化率达到85.26%。(2)通过Plackett-Burman设计筛选出影响甲烷氧化菌HNM1与煤之间接触角的主要培养基成分因素,结果表明硫酸镁、氯化铵和氯化钙是主要的影响因素。然后通过Box-Behnken试验对三个因素优化并进行回归分析,发现三个因素对接触角影响的显著程度为氯化铵硫酸镁氯化钙,通过对回归方程求解的到最优培养基组成为硫酸镁添加量0.15 g/L,氯化铵添加量0.31 g/L,氯化钙添加量为0.15g/L,理论最优条件下接触角为89.166°,验证试验实测为89.326°。(3)甲烷氧化菌HNM1可以快速吸附到煤表面,6 min达到吸附平衡,吸附率为44.65%。当pH值在5.5-7.0时,吸附率逐渐下降但趋势不大,pH值超过7.0后,吸附率下降较快;在24-36℃之间,温度变化对甲烷氧化菌的吸附率变化影响不大。(4)甲烷氧化菌在煤表面的吸附可以明显改变煤的接触角,煤的接触角从64.6°升高到87.72°。菌株在煤表面的吸附不会改变煤的组成结构,吸附处理后煤的饱和吸附容量从24.588 mL/g降到21.824 mL/g,吸附常数从1.02 MPa~(-1)升高到1.15 MPa~(-1),这种变化更有利与煤中甲烷的解吸附,说明甲烷氧化菌对煤的表面改性也是煤层瓦斯生物降解的有效促进途径。
【学位授予单位】：中国矿业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TD712
【图文】：

地图,水采,煤层,地图

甲烷氧化菌的存在[49, 66, 82-85]。由于生长环境的不同，研究人员从不同环境中得到不同种群的甲烷氧化菌[1, 20, 86-88]。目前对甲烷氧化菌的研究也有多个方以甲烷氧化菌进行高价值附加产物的合成，通过对甲烷氧化菌来研究地球环碳循环过程等[65, 86, 89-92]。郑燕[64]在研究土壤中甲烷氧化菌时利用新一代高测序技术和稳定性同位素示踪微生物核酸 DNA/RNA 技术揭示了土壤中甲化菌氧化甲烷时的生理生态过程。本章首先从煤矿煤层水中富集得到甲烷氧化菌混合菌群，并通过高通量测到该混合菌群的群落结构。通过传统方法从混合菌群中分离得到一株氧化甲能较好的甲烷氧化菌单菌株，对其进行基因测序确定该甲烷氧化菌种属，并菌株的生理生化性质进行了检验，对该菌的进一步研究获得了良好的基础。2.1 材料和方法（Materials and Method）.1.1 实验材料（1）甲烷氧化菌混合菌群从淮南张集煤矿中取回新鲜煤层水样品用于甲烷氧化菌混合菌群富集。

混合菌群,群落,菌群,黄单胞菌属

图 2-3 甲烷氧化菌在门（a）和属（b）水平上分布Figure 2-3 Distribution of methane oxidizing bacteria at phylum (a) and genus (b) level由图 2-3b 可得该菌群群落在属水平上的分布，其中嗜甲基菌科 Methylophilaceae 占 40.07%，是群落中的优势菌群；其次为甲基单胞菌属 Methylomonas 占 27.95%，还含有数量较少的甲烷氧化菌，如甲基孢囊菌属 Methylocystaceae (6.75%)，Methyloversatilis (1.04%)，Methylotenera (0.04%)，甲烷氧化菌共占群落组成的 75.85%；群落中其他菌群的分布为：假单胞菌 Pseudomonadales (4.73%),假黄单胞菌属 Pseudoxanthomonas(3.35%), 沉积小杆菌属 Sediminibacterium (1.55%), 金小杆菌属 Chryseobacterium (2.8%), Ferrovibrio (5.51%), 生丝微菌属 Hyphomicrobium (1.17%)。由此可得该甲烷氧化混合菌群中甲烷氧化菌占优势，适合从中分离出甲烷氧化菌纯菌株。2.2.2 甲烷氧化菌的分离纯化及形态观察通过平板涂布和划线法从甲烷氧化菌混合菌群中分离得到甲烷氧化菌菌株HNM1。将甲烷氧化菌 HNM1 划线接种在固体平板上，长出菌落后进行观察。

固体培养,生长形态,液体培养,混合菌群

图 2-3 甲烷氧化菌在门（a）和属（b）水平上分布re 2-3 Distribution of methane oxidizing bacteria at phylum (a) and genus (b 2-3b 可得该菌群群落在属水平上的分布，其中嗜甲基菌科 M 40.07%，是群落中的优势菌群；其次为甲基单胞菌属 Methylo还含有数量较少的甲烷氧化菌，如甲基孢囊菌属 Methylocysthyloversatilis (1.04%)，Methylotenera (0.04%)，甲烷氧化菌共85%；群落中其他菌群的分布为：假单胞菌 Pseudomonadales菌属 Pseudoxanthomonas(3.35%), 沉积小杆菌属 Sediminibact杆菌属 Chryseobacterium (2.8%), Ferrovibrio (5.51%), 生丝bium (1.17%)。由此可得该甲烷氧化混合菌群中甲烷氧化菌占离出甲烷氧化菌纯菌株。烷氧化菌的分离纯化及形态观察平板涂布和划线法从甲烷氧化菌混合菌群中分离得到甲烷氧将甲烷氧化菌 HNM1 划线接种在固体平板上，长出菌落后进

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