基于碳纳米管复合材料的心肌组织工程研究

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基于碳纳米管复合材料的心肌组织工程研究

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急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是由于冠状动脉血液供应急剧减少或中断导致的心肌缺血性坏死。心肌组织本身的再生能力非常有限，一旦坏死后，室壁进行病理性重建，坏死的心肌被纤维化的瘢痕组织取代，导致心肌收缩功能减弱甚至丧失，严重时引起死亡。目前，心肌梗死在临床中的主要治疗方法包括介入治疗、药物治疗、冠状动脉旁路手术以及心脏移植等等，但是这些方法均存在明显的局限性。例如，介入治疗、药物治疗与冠状动脉旁路手术只能在一定程度上缓解症状，而心脏移植则面临供体不足、移植后免疫排斥及并发症较多等难以解决的问题。因此，探索新的治疗策略与方法已成为目前缺血性心脏疾病治疗研究领域的迫切任务之一。
　　随着干细胞、生物材料与组织工程各研究领域的不断发展与交叉融合，针对受损心肌组织修复与重建的心肌组织工程研究近年来进展迅速，为缺血性心脏疾病的治疗带来了新的希望。种子细胞、支架材料及工程化心肌组织构建与移植是心肌组织工程研究的主要内容。
　　在种子细胞方面，干细胞是心肌组织工程研究的重要细胞来源。在过去的研究中，已有多种类型的干细胞被用于心肌组织工程研究，主要包括胚胎干细胞(ESCs)，诱导型多能干细胞(iPSCs)以及多种类型的组织干细胞。尽管这些种子细胞均表现出一定的心梗治疗潜能，但研究发现这些细胞在治疗应用中也存在一定的局限性，例如:ESCs存在免疫原性及伦理方面的问题;iPSCs具有致瘤性风险;间充质干细胞的成心肌分化能力低;心脏干细胞来源有限等等。到目前为止，理想的种子细胞来源在科学界仍未达成共识，因而寻找新的干细胞来源是当前心肌组织工程研究的热点之一。近年来的研究表明，棕色脂肪组织来源的干细胞(brown adipose tissue derived stem cells，BASCs)中含有丰富的心脏干细胞，具有较高的成心肌分化潜能。同时，体内移植研究也发现，BASCs移植到缺血性心肌后可以分化为心肌细胞，减少心梗面积，改善左室功能。因此，BASCs在心肌再生研究中具有重要的潜在应用价值，是心肌组织工程研究中重要的种子细胞来源之一。然而，由于发现时间较短，关于BASCs在心梗治疗中的应用还有待于深入研究。
　　在支架材料方面，研制合适的支架材料是心肌组织工程的关键环节。近年来，生物材料与纳米技术的迅速发展得到了研究人员的高度关注，其在心肌组织工程中的应用也成为了当前研究的热点之一。纳米材料与传统支架材料的成功整合已经成为优化传统支架材料、使其具备特殊理化性质的重要手段。鉴于心肌组织具有独特的电生理特性，心肌内分布着交织成网状的具有电传导性的浦肯野氏纤维。单个心肌细胞接受心脏传导系统传来的电冲动产生兴奋和收缩偶联，心室肌作为一个整体，发生同步收缩，完成泵血功能。因此，理想的心肌组织工程支架材料应该可以模拟心肌的胞外基质微环境;具有电传导特性及适宜的力学特性。然而，传统的支架材料不具备导电特性，而导电纳米材料与传统支架材料进行整合后，能够明显提高复合支架材料的导电性。因此，将具有导电性的纳米材料整合入传统支架材料的策略，引起了研究人员的极大兴趣。
　　碳纳米管(carbon nanotubes，CNTs)是一种圆柱状片层结构，具有优良的力学强度、导电特性及热稳定性。通过不同的方法与其他材料制备成复合材料后，可以使CNTs的溶解性增加、生物相容性改善、细胞毒性降低以及在很大程度上改善复合材料的力学性能及导电性能。与多壁碳纳米管(multi-wall carbonnaotubes，MWCNTs)相比，单壁碳纳米管(single-wall carbon naotubes，SWCNTs)的直径分布范围小，管壁缺陷少，具有更好的均匀一致性。SWCNTs的直径约为0.6-2nm，长度为微米级，比表面积较大。目前，在组织工程领域中，基于CNTs的复合导电性纳米支架材料已经得到了广泛的应用，并受到研究人员的高度关注。
　　在心肌组织构建与移植方面，主要有两种途径，分别为可注射性心肌组织工程及工程化心肌补片。
　　可注射性心肌组织工程:是指在心肌损伤部位，将可注射性支架材料单独注射或与细胞和/或生长因子复合后注射，促进受损心肌功能修复的一种策略。可注射性支架材料携带干细胞在心梗区域移植后，材料对心梗微环境有很好的改善作用，移植的细胞可以促进心肌的再生，而且，这种方法具有不用制备特殊支架及低侵袭性等特点，易于在临床上应用，因此，可注射性心肌组织工程是一个重要的研究方向。
　　用于心梗治疗的可注射性材料有很多种，如纤维蛋白，胶原，Matrigel，藻酸盐，自组装多肽及壳聚糖等。然而，这些材料都存在一定的缺点。近年来，聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶(poly N-isopropylacrylamide，PNIPAAm)的成胶特点及良好的生物相容性在临床上引起了人们的关注。PNIPAAm的相变温度(lowercritical solution temperature，LCST)为32℃，当PNIPAAm低于LCST时，流动性好，便于在器官、组织或体腔中注射;而在正常体温下，这种聚合物可以在原位快速形成凝胶。而且，PNIPAAm具有良好的生物相容性，可用于获取细胞片层。然而，将SWCNTs与PNIPAAm制备成水凝胶用于心梗治疗的研究目前尚未见报道。
　　工程化心肌补片:可以为细胞提供合适的微环境及结构支撑，促进移植细胞的分化，并可防止细胞凋亡。因此，心肌补片在心梗治疗中得到了广泛的关注并成为一个重要的研究方向。然而，大量研究均关注的是工程化心肌补片的构建与移植应用，对心肌补片影响心肌组织本身所其有的特化功能结构——闰盘(intercalated disc，ID)的研究，则鲜有报道。
　　ID存在于心肌细胞之间，是心肌细胞之间连接和通讯的重要结构，与心肌的电传导及节律性收缩密切相关，主要由粘着连接、桥粒和缝隙连接组成。其中，粘着连接和桥粒主要负责心肌细胞间的力学耦联;缝隙连接则与心肌细胞间的电耦联和代谢耦联相关。三者缺一不可，相辅相成，保证ID功能的正常发挥。我们前期曾以胶原/Matrigel水凝胶材料复合新生大鼠心肌细胞(neonate ratventricular myocytes，NRVM)体外构建了工程化心肌组织片层，深入研究了在ID自组装形成过程中，三种连接的时空分布规律。然而，对于SWCNTs构建的导电性工程化心肌组织片层，对心肌细胞间ID形成、组装与极化影响的报道，目前尚未见到。
　　基于上述分析，本论文从心肌组织工程研究的两个重要策略入手，开展以下两方面的研究。一方面，以PNIPAAm/SWCNTs构建可注射性支架材料，携带BASCs体内移植后对受损心肌进行功能修复的研究。另一方面，以SWCNTs/胶原复合支架构建工程化心肌组织补片，并研究SWCNTs对再造心肌ID形成、组装及功能成熟的影响。因此，本论文的研究内容分为两个部分:
　　第一部分:基于PNIPAAm/SWCNTs水凝胶的可注射性心肌组织工程研究
　　本研究首先制备了PNIPAAm/SWCNTs水凝胶，对其理化性能、细胞相容性及组织相容性进行了评价;并以BASCs为种子细胞，以PNIPAAm/SWCNTs水凝胶为可注射性支架材料，评估了PNIPAAm/SWCNTs水凝胶对体外培养的BASCs黏附、伸展及增殖的影响;另外，PNIPAAm/SWCNTs水凝胶携带BASCs心梗区域移植后，通过超声心动图及组织学等方法，评估了心梗后受损心肌的功能改善情况，并通过免疫荧光染色观察了BASCs在心梗区域的滞留及转归情况。
　　结果表明:与对照组PNIPAAm水凝胶相比，PNIPAAm/SWCNTs水凝胶的表面粗糙度明显增加，并具有优良的导电性。PNIPAAm/SWCNTs水凝胶具有良好的细胞相容性及组织相容性;体外培养条件下可以促进BASCs的黏附与增殖;在H2O2（作为外源性活性氧自由基，ROS）存在条件下，同样可以增加BASCs的黏附与伸展;利用PNIPAAm/SWCNTs水凝胶作为可注射性支架材料，携带BASCs心梗区域注射后，可以提高BASCs滞留率，增加室壁厚度，减少室壁梗死面积，抑制左室重建，改善心梗后受损心肌的功能。
　　第二部分:基于SWCNTs/胶原的工程化心肌补片构建及SWCNTs影响再造心肌ID发育的研究
　　本研究中，我们采用鼠尾Ⅰ型胶原与SWCNTs制备成复合支架，对其理化性质和生物相容性进行了评价;随后，利用筛选出的SWCNTs/胶原复合支架(0.1 mg/mL)作为基质，与NRVM共培养，构建了工程化心肌补片;在此基础上，我们对SWCNTs影响再造心肌补片ID组装、形成及功能发挥进行了研究。在不同时间点，通过免疫荧光染色、western blotting、透射电镜及NRVM的自发钙瞬变等方法，从形态学、分子生物学、超微结构和功能上，对再造心肌ID的蛋白表达、分布、组装与发育情况进行了评价。
　　结果表明:当SWCNTs的浓度为0.1mg/mL时，，SWCNTs在胶原溶液中分散均匀，没有明显的聚集现象，与扫描电镜结果一致;随SWCNTs浓度的增加，胶原溶液中SWCNTs出现不同程度的聚集;原子力显微镜结果说明随SWCNTs浓度的增加，复合支架的表面粗糙度也随之增加;对复合支架的电传导性进行测量后，SWCNTs浓度与复合支架的导电性呈正相关。Live/Dead染色结果提示:与其他4组相比，SWCNTs浓度为0.1mg/mL时对细胞活力的影响最小，说明SWCNTs/胶原(0.1mg/mL)组具有更好的生物相容性。
　　与单纯胶原对照组相比，基于SWCNTs/胶原复合支架构建的工程化心肌补片，其免疫荧光染色和透射电镜检测结果均表明SWCNTs不但明显增强再造心肌组织α-actinin蛋白的表达，可见明显的肌节结构，而且显著促进了缝隙连接蛋白Connexin43蛋白的极化，这提示基于SWCNTs/胶原再造心肌补片具有更加成熟的组织结构和更好的收缩性能。同时，也证实了SWCNTs可以明显促进再造心肌ID组装形成与功能成熟。
　　综上所述，一方面，本研究成功制备了基于含SWCNTs的PNIPAAm水凝胶，并将这种可注射性水凝胶与BASCs复合后用于心梗区域移植。研究发现，PNIPAAm/SWCNTs水凝胶体外培养时可以促进BASCs黏附与增殖，体内移植后可以促进受损心肌修复，改善梗死区心脏功能。这种基于PNIPAAm/SWCNTs的可注射性水凝胶支架材料对缺血性心脏疾病的治疗具有重要意义。另一方面，本研究成功制备了基于胶原功能化的SWCNTs的工程化心肌补片。研究发现，基于SWCNTs的胶原复合物支架可以促进再造心肌ID的组装与发育成熟。相关研究不但为SWCNTs/胶原构建的工程化心肌补片在体内进一步应用奠定了基础，而且对SWCNTs在工程化心肌组织补片中的治疗应用具有重要的意义和价值。

作者 李霞

学科专业 病理学与病理生理学

授予学位 博士

授予单位 中国人民解放军军事医学科学院;解放军军事医学科学院

导师姓名 王常勇

学位年度 2014

关键词 胶原;PNIPAAm水凝胶;心肌梗死;组织工程

分类号 R318.08

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