以新型组织工程材料构建组织工程骨及体内成骨基质细胞的初步研究

发布时间：2015-01-01 10:19

 

【摘要】 目的：兔骨髓基质细胞体外诱导为成骨细胞，构建骨髓基质成骨细胞和赖氨酸纳米生物材料的复合培养模型。探讨以赖氨酸生物活性材料作为骨组织工程支架材料，以及赖氨酸生物活性材料与成骨细胞复合体体内成骨情况。方法：取兔骨髓在体外分离出骨髓基质细胞(MSCs)，利用骨髓基质细胞贴壁生长的特点，体外培养骨髓细胞。用加有地塞米松，β—甘油磷酸钠和VitC的诱导培养基进行诱导培养，使其成为骨髓基质成骨细胞，观察其形态学特点，用碱性磷酸酶(ALP)，Ⅰ型胶原和骨髓基质细胞体外成骨能力的检测等方法鉴定其生物学特性。以赖氨酸乙酯二盐酸盐为原料用纳米技术合成的新型生物材料利用气体发泡法并结合颗粒滤除法制孔。用诱导后的兔骨髓基质成骨细胞与其复合培养，在光镜(HE染色)和电镜下观察成骨细胞在材料上的粘附、生长情况。将复合培养与原诱导培养BMSC进行ALP含量比较，然后将复合培养后的细胞进行再培养，观察材料对细胞增殖及生物活性的影响。最后将细胞材料复合物植入原家兔腿部肌肉，组织学观察。结果：骨髓基质细胞呈贴壁生长，诱导后可向成骨细胞分化，细胞呈成骨细胞形态为梭形和多角形，无接触抑制，可形成钙化结节。用改良钙钴染色法检测得诱导细胞碱性磷酸活性呈强阳性。Ⅰ型胶原染色阳性。骨髓基质成骨细胞可以在赖氨酸纳米生物活性材料上继续粘附、生长、增殖和分化。扫描电镜检测可见多空材料孔隙率可达90％，孔径在100-300μm，孔隙内也可见成团的细胞长入，多呈梭型，被细胞外基质包围。复合培养BMSC与原诱导培养BMSC的ALP含量比较，没有差别(p＞0.05)。再培养细胞增殖能力没变化(p＞0.05)。组织学见4w时见出现大量致密的不规则类骨质，在其周边可见成骨细胞聚集增多，部分区域出现骨陷窝结构，8w时出现大量较典型的骨小梁结构。结论：用骨髓基质在体外诱导成为成骨细胞可以作为骨组织工程选择种子细胞的方法。以赖氨酸二异氰酸酯为原料制成的纳米骨材料可以作为骨组织工程的支架材料，成骨细胞接种于新型骨组织工程材料上在体外培养，可以生长、增殖和分泌细胞外基质，材料与细胞间有很好的生物相容性。材料与细胞的复合物体内可以成骨，骨髓基质成骨细胞与赖氨酸纳米生物活性材料构建新型组织工程骨是可行的。 

实验流程图

 

材料与方法

 

1、实验材料
1.1动物
家兔，四月龄，体重2kg左右，4只，雄性，由中南大学实验动物部提供
1.2药品
肝素(loou/ml)                        湘雅医院药剂科
高糖DMEM培养基                       长沙丽欣生物技术有限公司
PBS平衡盐溶液                        试验室自制
Percoll淋巴分离液                    上海华精生物高科技有限公司
B一甘油磷酸钠                        Sigma公司产品
胰蛋白酶(0.25%)                      长沙丽欣生物技术有限公司
鼠抗兔I型胶原抗体                    北京中山公司
15%小牛血清                          中南大学细胞中心
Dex(10一smox/l)                      湘雅医院药剂科
戊巴比妥钠                           湘雅医院药剂科
Vitc(5oug/ml)                        湘雅医院药剂科
青霉素(loou/ml)                      湘雅医院药剂科
链霉素(100ug/ml)                     湘雅医院药剂科
地塞米松(10-8mol/I)                  湘雅医院药剂科

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2、实验方法

2.1BMSC的分离、增殖及诱导培养
培养瓶中加sml完全培养基，置入37℃，5%COZ培养箱中培养。3d后首次换液，以后隔天换液一次。当细胞长满培养瓶底80%时吸除培养基，笔耕文化推荐期刊，加入适量0.25%胰蛋白酶消化细胞，当观察到细胞突起回缩、形态变圆、细胞间隙增大时，加入含巧%小牛血清的DMEM液Zml中止消化，吹打使细胞脱壁并分散为单个细胞，收集消化所得的细胞悬液至离心管中，以1000印m离心1omin，弃上清液，加入完全培养基制成细胞悬液并混合均匀，以1:2的比例传代培养即1个25ml培养瓶中的细胞消化后接种在2个25nil培养瓶中培养。取生长良好的二代细胞分为两组:实验组加入条件培养基(DMEM+15%FCS+10~o扒p一甘油磷酸钠+0.1pmol几地塞米松+som幼Vite)，37oC，5%COZ，饱和湿度静置培养，每2天半量换液一次，连续培养1一2周。对照组继续用完全培养基培养。
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结果···········11
1、相差显微镜观察··········11
2·复合后光镜观察··········15
3、扫描电镜观察··············16
4、复合培养后碱性磷酸酶(ALP)含量比较········18
5、再培养成骨细胞的观察············19
6、复合体植入家兔腿部肌肉的组织学观察·······20

讨论·············23

 

讨论

 

骨组织工程要求在体外提供有利于成骨细胞成骨的正常的细胞生存环境，即适合细胞种植的基质材料(支架材料)。在骨组织工程中理想的支架材料要求满足以下条件:①良好的生物相容性:除满足生物材料的一般要求，如无毒、不致畸之外，还要有利于种子细胞的粘附、增殖，降解产物对细胞无毒害作用，不引起炎症反应，有利于细胞的生长和分化。②良好的生物降解性:支架材料在完成支撑功能后应能降解，降解速率应与骨组织细胞生长速率相适应。③具有三维立体多孔结构:支架材料可加工成三维立体结构，孔隙率高，最好达90%以上，具有高的比表面积。这种结构可提供宽大空间，利于细胞粘附生长、细胞外基质沉淀、营养和氧气进入、代谢产物的排出，也有利于血管和神经长入。④可塑性和一定的机械强度:支架材料具有良好的可塑性，可预先制作成一定形状，并具有一定的机械强度，为新生组织提供支撑，并保持一定时间直至新生组织具有适当力学特性。⑤良好的材料一细胞界面:材料应提供良好的材料细胞作用界面，利于细胞粘附、生长，更重要的是能激活细胞特异基因表达，维持正常细胞的表型表达。目前还没有一种支架材料可以全部满足以上要求。因此，我们将“绿色化学”的原理应用于组织工程领域，即用于纳米生物医学材料合成的全部原料均为无毒并可被人体吸收的物质，包括反应溶剂。利用纳米技术以赖氨酸乙酷二盐酸盐为基质通过有机合成、聚合反应采用超临界二氧化碳聚合及超生波分散技术合成了这种纳米高分子材料。这种纳米高分子材料有望符合骨组织工程对支架材料的要求。

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结论

 

骨缺损的治疗一直是临床上有待解决的难题之一，组织工程的发展为这一问题的解决带来了新的希望，本试验就是依据组织工程的原理，以及细胞培养体外实验来证明新型的骨组织工程材料。基于本实验的结果，我们得出以下结论:
1.成骨细胞接种于新型骨组织工程材料上在体外培养，可以生长、增殖和分泌细胞外基质。
2.由骨髓基质成骨细胞和这种赖氨酸纳米生物活性材料的复合体在动物体内能形成骨组织。

3.本实验证明了，以赖氨酸乙酷二盐酸盐为原料制成的纳米骨材料可以作为骨组织工程的支架材料及以这种材料构建新型的组织工程骨的可行性。

 
参考文献:
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本文编号：10969