基于核酸适体功能化复合金属纳米材料的肿瘤诊疗研究

发布时间：2018-03-22 16:53

本文选题：诊断治疗学　切入点：核酸适体　出处：《湖南大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：诊断治疗学是一种将治疗学与诊断学结合起来的新兴治疗策略,同时也被医学界视为未来众多疾病疗程的主流,有望为个体化医学的实现起到极大的推动作用。设计与合成高靶向、高灵敏、高疗效、高稳定和低毒副作用的“诊疗一体化”多功能探针则是诊断治疗学技术发展和应用中的重中之重。近年来,伴随着纳米技术的出现和快速发展,一系列具有特殊物理化学性质的功能化纳米材料被不断开发出来,为“诊疗一体化”多功能探针的构建提供了新的契机。同时,作为化学“抗体”,核酸适体则因分子量小、免疫原性低、易化学合成与标记等诸多优势而在肿瘤诊断与治疗领域中获得了重要关注,特别是在用于活体等复杂体系时,核酸适体往往表现出血液和非靶器官中滞留时间短、组织内渗透和摄取速度快以及靶组织聚集率高等特点,为发展具有在复杂体系中高效靶向能力的“诊疗一体化”多功能探针提供了一种理想的分子识别元件。因此,本论文瞄准构建与发展新型“诊疗一体化”多功能探针这一前沿研究热点,拟以合成新型的复合金属纳米热疗材料为前提目标,同时结合Aptamer(核酸适体)作为靶向识别探针的优势,设计和构建多种新型肿瘤诊疗探针。具体包括以下几方面的工作:一、Au@Ag-Au纳米颗粒的合成及其肿瘤光热治疗应用研究金纳米棒,因其优异的性能,包括易合成、灵活标记、在近红外区域具有可调的吸收波谱以及大的消光系数而被广泛地应用于体内外肿瘤选择性光热治疗。然而,合成过程中模板剂CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)本身所带来的细胞毒性以及金纳米棒相对薄弱的近红外吸收可能限制其在生物医学领域中的进一步应用。为此,本文采用在金纳米棒外面包被银/金合金的方式,发展了一种形状可控波谱可调的方法用于Au@Ag-Au纳米颗粒的合成。电镜和紫外可见波谱分析表明,纳米颗粒的形状和大小由金纳米棒外包被银层的厚度决定,而银/金合金纳米壳的存在则能有效提高复合纳米颗粒的近红外吸收。通过条件优化,最终获得的Au@Ag-Au纳米球(Au@Ag-Au NSs)大小约为40 nm,吸收波谱分布宽且强(400-1100 nm),而且毒性较低;与金纳米棒相比,Au@Ag-Au NSs的热疗效果增强了4.7倍左右。随后以人肺腺癌细胞A549为模型,对Au@Ag-Au NSs的细胞杀伤性能进行了一系列的表征。结果表明,在980 nm激光照射下,Au@Ag-Au NSs能有效地杀伤肿瘤细胞,通过进一步提高颗粒浓度,延长孵育或者是光照时间细胞的光热杀伤效果明显增强。此外,初步的活体研究表明,注射有Au@Ag-Au NSs的肿瘤在施以激光照射后产生了明显的坏死现象。由此可见,Au@Ag-Au NSs作为一种高效而有发展前景的近红外光热治疗试剂,在生物医学研究领域中显示出极大的应用潜力。二、基于核酸适体功能化au@ag-au球形纳米颗粒的激活式肿瘤成像及其引导下的光热治疗研究目前,基于纳米材料所构建的诊疗探针越来越受到人们的关注并在肿瘤治疗中显示出极大的应用前景。然而,对于同时具有高特异性、高成像对比度及治疗功效的多功能诊疗纳米探针的开发仍然存在着很大的挑战。基于此,本文通过将激活式aptamer探针(aap)组装到具有在近红外区高光热转换效率的au@ag-aunss上,成功构建新型激活式诊疗纳米探针(atnp)。其中,au@ag-aunss作为淬灭剂同时也充当产热试剂,不仅展现出良好的荧光淬灭性能,而且,与金纳米棒相比,近红外区的产热效率更高;aap探针则是由一条具有肿瘤细胞特异性识别能力的巯基化aptamer和与该aptamer部分序列互补的标有荧光基团的短链dna(cdna)组成。当体系中没有靶标存在时,aap探针保持着稳定的双链构型,cdna所带荧光分子与au@ag-aunss表面靠近,导致荧光信号处于淬灭状态;而当加入靶肿瘤细胞后,由于aptamer与细胞膜上的靶标结合并形成特定构型,从而在将au@ag-aunss带至细胞表面的同时也破坏了aap探针的双链结构,使得cdna远离颗粒表面,荧光信号得到激活而升高。通过监测该体系中的荧光信号变化情况可指示靶肿瘤细胞的位置所在,且根据上述荧光激活信号的引导,在清楚了解病灶位置和类型的基础上,可有效实施定点、按需的近红外光热治疗。随后,以人肺腺癌细胞a549作为肿瘤模型,系统考察了atnp在体内外的成像及治疗行为。结果表明,atnp确实能大大地提高肿瘤成像对比度,同时完成特异性的肿瘤光热杀伤,在将来有望作为一种强有力的、通用的诊疗策略用于个体化医学。三、基于核酸适体功能化cu-au纳米颗粒诊疗探针的肿瘤活体荧光成像与光热治疗研究作为肿瘤诊疗中的常用材料,具有光响应性能的金纳米材料依然存在着一些不足,比如导热系数低,激光诱导的熔化效应以及成本较高等。基于此,本文采用一种简便、温和、一锅煮的合成方法,通过引入成本低、导热性更高的铜元素,制备了一种新型的cu-au合金纳米结构(cu-auns)。通过结合cu和au各自的优点,所制备的cu-aunss呈现出宽而强的近红外吸收带;与金纳米棒相比,cu-aunss在激光照射下展现出更高的产热效率以及光稳定性。随后,通过将标有荧光基团的aptamer(f-apt)修饰到cu-aunss上以构建基于f-apt包被cu-aunss的诊疗平台(cu-au@f-aptnss)。随即选择人白血病细胞ccrf-cem及其aptamercy5-sgc8c为模型,成功实现了cu-au@cy5-sgc8cnss对体外肿瘤细胞以及体内肿瘤组织的选择性荧光成像与近红外光热治疗。综上所述,基于cu-au@f-aptnss的诊疗平台具有构建简便、稳定、生物相容性好和高效等优点,有望作为一种通用的工具用于肿瘤诊疗。四、基于碘响应性Cu-Au纳米颗粒的肿瘤细胞高灵敏比色检测研究比色法,因其具有可视化、简单、快速、成本低、不需要昂贵仪器等优点,而成为一种非常有发展潜力的肿瘤细胞检测方法。然而,目前所报道的方法大都存在着灵敏度低、探针合成或设计复杂等缺陷。基于此,本文巧妙地选取了具有碘特异性响应性能的Cu-Au纳米颗粒(Cu-Au NP)作为有效桥梁,利用其对碘的化学吸收作用和易于生物修饰性能,将碘催化H2O2-TMB显色体系与分子识别探针进行定量相关,建立了一种具有通用性的新型比色分析技术平台。在此基础上,进一步选择人白血病细胞CCRF-CEM作为模式生物靶标,利用Aptamer Sgc8c修饰的Cu-Au NPs(Sgc8c-Cu-Au NPs)作为探针对其进行检测分析。结果表明,基于Sgc8c-Cu-Au NPs可成功实现简便、免标记、低耗、可视、高选择性和高灵敏的靶细胞分析。此外,该方法还适用于复杂的血清样品分析。因此,本文所发展的方法不仅能极大地拓展碘催化显色体系的应用领域,而且将为发展简便、快速、灵敏和特异的癌细胞比色分析方法提供一种全新的思路。五、具有高催化活性和强等离子体共振特性的Cu-Au-Pt纳米颗粒合成与肿瘤诊疗应用研究双金属或者是多元素金属纳米颗粒,由于协同效应被赋予新的、增强的性能而越来越受到研究人员的关注。本文发展了一种简便、温和、一锅煮的方法用于合成催化活性好与产热能力强的Cu-Au-Pt复合纳米颗粒(Cu-Au-Pt NPs)。通过在Cu-Au-Pt NPs表面修饰上具有靶向功能的Aptamer探针,成功构建了一种制备简便、免标记的诊疗探针。在此基础上,选择人白血病细胞CCRF-CEM作为模型,考察了所构建探针对靶细胞的选择性检测能力及光热杀伤效果。鉴于靶识别分子的多样性,同时结合Cu-Au-Pt NPs优越的催化及产热性能,有望发展一种通用的平台用于生物传感及其它生物医学研究。
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【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TB383.1;R730.5

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