CaMKⅡα蛋白的异源表达及与纳米材料相互作用的初步研究

发布时间：2018-04-27 10:48

  本文选题：富勒烯纳米晶体 + 表达优化　； 参考：《华中科技大学》2015年硕士论文

【摘要】：纳米材料进入生物体后,会接触上千种蛋白,引起多种生物学效应甚至产生毒性,其原因主要是纳米材料与体内细胞、蛋白质等相互作用。纳米材料与蛋白质结合后会对其构型、活性和稳定性等产生影响,进而改变蛋白结构和功能。富勒烯纳米晶体具有独特的三维共轭结构和物理化学性质,因此在医学和生物学领域中极具潜力,其应用包括DNA的光剪切、酶抑制作用、肿瘤治疗、药物载体、抗菌和细胞保护等。研究已表明富勒烯纳米晶体(C60)具有与N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)受体NR2B亚基相似的功能,通过与钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱα(CaMKⅡα)发生特异、稳定性相互作用,从而将其锁定在活化状态,引发特定信号传递,促进学习与记忆过程。研究纳米材料与蛋白质相互作用,将有助于全面了解其作用机理,同时也为其开发新的医学应用及安全性设计提供了重要的理论依据。本论文主要分为两个部分:(1)为了提高表达量,将CaMKⅡα蛋白在不同标签的载体中进行融合表达,并对表达条件进行优化。结果表明在pET22b载体中,菌种按0.1%接种量,加入0.2mM IPTG,在16℃条件下诱导16 h表达效果最好。随后通过亲和层析、分子筛等纯化操作,以其获得可溶性的目的蛋白,为后续实验提供足够样品。(2)通过溶剂置换法制备了C60水悬液,并用UV、DLS对其进行了表征。利用Langmiur平衡吸附等温模型考察了1μg C60可最大结合5.435μg CaMKⅡα蛋白。DLS结果显示纳米晶体吸附蛋白后以单体形式为主,仅有少量的团聚体。随后在模拟生理条件下,利用光谱实验和分子模拟技术研究了不同温度下C60与CaMKⅡα相互作用结合参数。结果如下:根据荧光猝灭原理判断猝灭机制为静态猝灭,并得出在298 K,310 K和318 K三个不同温度下的结合常数分别为4.87×105,6.47×105,7.65×105 L·mol-1。通过计算热力学参数,焓变ΔH为正值(209.805 kJ/mol),熵变ΔS为正值(778.364 J/mol/K)。由此推断C60与CaMKⅡα结合是靠疏水作用进行的自发反应,与分子模拟结果一致。分子模拟研究进一步表明,C60主要以π-π键形式和蛋白分子中芳香族或带电残基结合,是对热力学实验很好的补充。紫外光谱和同步荧光光谱结果说明C60可以引起蛋白疏水腔中Trp残基周围微环境的疏水性降低,极性增加。此外,根据圆二色谱的拟合数据,定量计算了蛋白分子二级结构,表明C60对蛋白二级结构没有显著的影响,仅使α-螺旋降低了1.8%,β-折叠升高了1.1%。
[Abstract]:After the nanomaterials enter into the organism, they will come into contact with thousands of proteins, which will cause many biological effects and even produce toxicity, mainly due to the interaction of nanomaterials with cells, proteins and so on. The structure, activity and stability of nanomaterials are affected by their binding with proteins, and then the structure and function of proteins are changed. Fullerene nanocrystals have a unique three-dimensional conjugate structure and physical and chemical properties, so they have great potential in medical and biological fields. Their applications include DNA photoshear, enzyme inhibition, tumor therapy, drug carriers, etc. Antibacterial and cell protection. It has been shown that fullerene nanocrystalline (C60) has a similar function to the NR2B subunit of N- methyl D- aspartic acid (NMDA) receptor, and it interacts with Ca ~ (2 +) / calmodulin dependent protein kinase 鈪，

本文编号：1810424