基于纳米材料的大肠杆菌检测及抗菌肽递送系统的研究

发布时间：2018-06-22 21:55

本文选题：分子探针 + 纳米金　；参考：《南京农业大学》2015年博士论文

【摘要】：本论文基于纳米材料在高灵敏度检测与药物递送方面应用,首先将纳米金与分子信标结合,设计一种可以快速、灵敏、特异性检测尿道病原菌的纳米金DNA探针;接着将纳米材料介孔二氧化硅与连接肿瘤细胞靶向肽的抗菌肽RGD-hylina 1结合,实现pH依赖的抗菌肽释放,从而达到减毒增效的目的。研究包括以下三个方面的内容:1纳米金DNA探针快速灵敏检测大肠杆菌研究本文基于纳米材料设计了一种纳米金分子探针用于提高尿道病原菌检测的效率和灵敏度。本研究为达到快速灵敏检测尿道病原菌的目的,根据细菌保守通用16S rRNA设计DNA分子探针。检测原理为当无目标序列存在的情况下该探针通过尾部互补序列形成颈环结构,处于尾部的荧光分子FAM被临近淬灭基团BHQ1所淬灭;当目标序列出现后,颈环结构被打开,FAM远离淬灭基团,产生荧光,根据荧光强度判断目标序列浓度。本研究首先制备纳米金,通过紫外分光光度计与TEM对纳米金进行表征;然后将DNA探针富集到13 nm纳米金表面,通过DLS检测连接情况;接着对比DNA探针与纳米金DNA探针检测大肠杆菌灵敏度;同时设计目标序列、4个错配碱基序列、完全不相关序列及不相关3008 bp DNA质粒检测DNA探针与纳米金DNA探针特异性;病人尿液样本检测DNA探针与纳米金DNA探针对尿路感染病原菌灵敏性;最后研究纳米金DNA探针在血清环境中对大肠杆菌检测能力,分析纳米金DNA探针抗干扰性。结果显示:本研究制备的纳米金具有较均一的粒径,并且DNA探针与纳米金成功连接;通用对荧光强度的检测,证明该纳米金DNA探针可以在1h内检测102 cfu/ml E.coli,灵敏度是单独使用DNA探针的103倍;同时DNA探针与纳米金DNA探针均具有较强特异性和抗干扰性(P0.04)。结果表明:本研究首次以DNA纳米探针进行快速、灵敏度高且特异性强的大肠杆菌检测,解决传统检测方法步骤繁琐,费用高,时间长的缺点;并且该检测方法具有易制备、低成本的特点,通过改变DNA探针序列还可以应用到动物细菌、病毒、家畜早孕及食品安全等高灵敏检测中。2基于纳米材料介孔二氧化硅(HMS-COOH)的载药系统中靶向抗菌肽序列的研究针对目前肿瘤药物治疗存在毒副作用大的问题,本研究基于纳米材料介孔二氧化硅设计通过PH值依赖药物释放的载药系统;首先为寻找新型抗肿瘤及适合介孔二氧化硅运载的药物,本研究选择来源于南美树蛙皮肤中抗菌肽hylin a1,并以抗肿瘤性研究较为成熟的抗菌肽蜂毒素(melittin)做为参照,连接不同特异性的肿瘤细胞靶向肽SP94与RGD,比较连接前与连接后多肽之间的抗肿瘤性和溶血性差异,从中选择适合作为介孔二氧化硅运载的靶向抗菌肽;同时研究靶向多肽结构及长度对抗菌肽生物活性影响。结果显示:比较melittin、SP94-melittin、RGD-melittin促肿瘤细胞凋亡性,我们得到RGD-melittin促肿瘤细胞凋亡性作用最强,其次为melittin,最低为SP94-melittin;比较三者溶血性结果得到连接有RGD的melittin在0.2、1、2μM处与melittin、SP94-melittin相比降低了自身溶血性,具有极显著差异(P0.01)或显著差异(P0.05),连接有SP94的melittin溶血性与melittin相比差异不显著(P0.05)。据此我们推测靶向肽的长度、空间结构、特异性会影响多肽活性及功能,因此我们在设计多功能杂合肽要考虑各肽长度、空间结构、生物活性之间的相互影响。通过上面结果我们选择对抗菌肽活性影响较小的RGD与hylin a1进行连接,发现hylin a1与RGD-hylin a1促肿瘤细胞凋亡性相比无显著差异(P0.05);溶血性研究表明hylin a1与RGD-hylin a1仅在7μM具有显著差异(P0.05,38.7%vs 19.7%),其他浓度差异均不显著(P0.05)。结果表明:我们所设计的RGD-hylin a1抗菌肽适合做为介孔二氧化硅运载的药物。3纳米材料介孔二氧化硅(HMS-COOH)结合靶向抗菌肽RGD-hylin a1促肿瘤细胞凋亡研究基于纳米材料可以靶向聚集于肿瘤组织处特点,同时根据上文对几种抗菌肽研究选择RGD-hylin a1作为运载药物,通过静电作用负载于介孔二氧化硅(HMS-COOH)上形成RGD-hylin a1-HMS载药递送系统。结果显示:本研究选择的HMS-COOH具有促肿瘤细胞凋亡性,随着HMS-COOH浓度增加细胞凋亡率逐渐提高,但HMS-COOH不具有溶血性。RGD-hylin a1-HMS在pH=7的环境低浓度6、12.5ug/ml促肿瘤细胞凋亡率低于pH=5.5的环境,差异极显著(P0.01),因而所形成的载药系统具有pH依赖的药物释放特点。溶血性研究表明RGD-hylin a1-HMS与RGD-hylin a1相比溶血性显著降低(P0.05)。综上结果表明:RGD-hylin a1负载于介孔二氧化硅(HMS-COOH)上形成的载药系统实现了pH依赖的药物释放,达到降低对正常细胞的伤害性和RGD-hylin a1自身溶血性的效果。
[Abstract]:This paper is based on the application of nano - gold - DNA probe in high - sensitivity detection and drug delivery , firstly , combines nano - gold with molecular beacon to design a nano - gold DNA probe which can quickly , sensitively and specifically detect the pathogenic bacteria of urethra . In this study , the effect of RGD - hylin a1 on anti - tumor cell apoptosis was compared with that of melittin and SP94 - melittin .
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61;TB383.1

【参考文献】