逐级pH响应纳米载药体系的制备及克服肿瘤多药耐药性的研究

发布时间：2018-06-30 16:57

本文选题：逐级释药 + pH　；参考：《河北大学》2015年硕士论文

【摘要】：肿瘤是目前威胁人类生命的最严重的疾病之一。据统计,90%以上的肿瘤患者是因为耐药性而导致临床化疗失败。导致肿瘤耐药性的原因是多方面的,其中由于肿瘤的快速增长,肿瘤微环境表现出的一些异常现象,如高压、缺氧、酸性环境以及新生血管生成现象进一步导致了肿瘤的耐药性。肿瘤间质中的高压现象直接导致抗癌药物难以进入肿瘤组织;肿瘤缺氧环境会激活低氧诱导因子(HIF-1)生成而导致肿瘤细胞的耐受能力增加;而新生血管生成会促进血栓形成并导致血氧供给不通畅。这些特定的肿瘤微环境为化疗药物到达肿瘤组织设置了巨大的障碍。因此,如何增加化疗药物在耐药肿瘤内的有效浓度是治疗肿瘤的关键。本课题设计并合成多功能逐级p H响应释药的纳米载药体系,该体系具有显著的长循环功能。它可以先释放抗肿瘤血管药物改善肿瘤微环境,使肿瘤血管暂时“正常化”,为肿瘤血管给药提供有利条件,然后增加抗肿瘤药物在耐药肿瘤细胞内的有效药物浓度,从而协同发挥作用抗多药耐药肿瘤。本课题采用抗肿瘤新生血管药物康普瑞汀A4(CA4)和聚天冬氨酸-肼-阿霉素大分子前药(Pasp-DOX)作为药物模型,将具有生物相容性的聚乙二醇-组氨酸共聚物(简称PEG-Phis)作为药物载体来制备纳米载药胶束。本课题主要对聚合物的合成及结构确证、纳米胶束的制备和制剂学性质、细胞毒性、细胞内吞及其内吞机制、体内药代动力学和药效学行为进行研究。(1)以聚组氨酸为疏水基团,聚乙二醇为亲水基团,通过开环聚合反应合成不同长度疏水链的聚乙二醇-组氨酸共聚物(简称PEG-Phis20、PEG-Phis40、PEG-Phis60、PEG-Phis80),采用1H-NMR确证目标化合物的结构,并采用酸碱滴定法选取在p H5.6-7.1的范围具有显著缓冲能力的PEG-Phis40和PEG-Phis60共聚物作为纳米药物载体,同时采用尼罗红荧光探针法测定选取载体的临界胶束浓度;抗肿瘤药物阿霉素(DOX)以p H响应断裂的腙键(肼键)键合到聚天冬氨酸上合成大分子前药聚天冬氨酸-肼-阿霉素(Pasp-DOX),并采用1H-NMR确证了目标化合物的结构。(2)以抗血管药物康普瑞汀(CA4)和聚天冬氨酸-肼-阿霉素(Pasp-DOX)作为药物模型,以聚乙二醇-组氨酸共聚物PEG-Phis40和PEG-Phis60共聚物为纳米药物载体,采用一步纳米沉淀法制备胶束。以粒径、包封率以及血清稳定性作为指标,对纳米胶束的制备工艺和处方条件进行优化和筛选,并对纳米胶束的制剂学性质进行考察。TEM和DLS结果均显示,与PEG-Phis40共聚物形成的纳米载药体系相比,PEG-Phis60共聚物形成的纳米载药体系分散性较好、粒径均一、呈球形,对CA4和DOX的包封率分别为98.1%和96.1%,而且血清稳定性较好,因此优选PEG-Phis60制成的纳米载药体系进行后续研究。我们通过体外模拟肿瘤微环境以及肿瘤细胞内溶酶体的酸度值,把PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4纳米载药体系加入到不同p H值的酸性环境进行粒径检测。实验结果显示,随着酸度增加,PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4纳米载药体系的粒径随之变大,且TEM检测显示,p H 5.0条件下,PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4纳米载药体系发生解胶束行为。采用透析法考察该纳米载药胶束中的CA4和DOX两种药物的体外释放,结果表明,纳米载药胶束的CA4和DOX的释放具有p H响应性。p H 7.4条件下CA4在12 h内累计释放量为8.7%,而在p H 6.6条件下CA4发生突释,12 h累计释放64.1%。而DOX的释放相对持久,当p H变化到5.8,DOX释放加速,14 d累积释放量达到57.1%。此种释药方式说明该纳米载药体系可以先释药改善肿瘤微环境,使肿瘤血管暂时“正常化”给肿瘤血管给药提供有利条件,然后抗肿瘤大分子前药进入肿瘤细胞后断裂腙键释放抗肿瘤药物,以此达到协同抗肿瘤的目的。(3)以人脐静脉血管内皮细胞HUVEC作为模拟体内肿瘤血管微环境的细胞模型,以乳腺癌敏感株MCF-7细胞(乳腺癌耐药株MCF-7/ADR细胞)作为体内肿瘤细胞的模型,通过检测这两种细胞的先后杀伤顺序进一步证明PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4纳米载药体系确实具有响应肿瘤微环境和肿瘤细胞溶酶体的p H而程序释药的性质。分别以MCF-7和MCF-7/ADR细胞为模型,以CA4、DOX、Pasp-DOX、DOX+CA4、Pasp-DOX+CA4、PEG-Phis60/DOX/CA4等制剂为参照,检测PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4的细胞毒性、细胞内吞及内吞机制等。MTT实验表明,对于MCF-7细胞,各制剂均具有一定的抗肿瘤活性,但对于MCF-7/ADR细胞,各药物制剂的抗肿瘤活性表现出很大差异。其中PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4制剂在MCF-7/ADR细胞中呈现显著的细胞毒性,能显著地克服肿瘤的多药耐药性。采用流式细胞仪和共聚焦显微镜技术评价了纳米载药胶束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4在MCF-7以及MCF-7/ADR细胞中内吞情况,结果表明纳米载药胶束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4能显著提高药物在耐药肿瘤细胞中的内吞,内吞抑制实验表明两种纳米载药体系具有不同的入胞方式。(4)采用非房室模型模拟了各制剂在小鼠体内的药动学性质。药动学参数表明,纳米载药胶束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4能够显著提高阿霉素药时曲线下面积,增加药物在血浆中的循环时间,达到长循环的效果,从而能更好地使纳米胶束通过EPR效应分布到肿瘤区域发挥疗效。体内药效学结果表明,纳米载药胶束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4能显著抑制荷耐药性乳腺癌移植瘤BALB/C裸鼠的肿瘤增长,抑瘤率达到91.8%。体内脏器及肿瘤荧光成像实验结果表明,纳米载药胶束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4具有一定的肿瘤靶向性,而较少分布于正常组织。Masson三原色法和CD31免疫组化染色结果表明纳米载药胶束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4具有抗肿瘤新生血管生成并显著改善肿瘤微环境的作用,小鼠肿瘤切片的TUNEL和HE染色实验结果显示纳米载药胶束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4能显著地引起肿瘤细胞的凋亡。同时WBC实验表明纳米载药胶束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4可以显著降低DOX的心脏毒性,荷瘤裸鼠体重的变化以及正常脏器(如心、肝、肾)的HE染色等结果显示纳米载药胶束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4能显著降低化疗药物毒副作用,生物安全性高。
[Abstract]:A nanometer drug - carrying system for treating tumor is composed of poly ( polyethylene glycol - Phis20 , PEG - Phis40 , PEG - Phis60 , PEG - Phis80 ) with biological compatibility . The results showed that PEG - Phis60 / Pasp - A / CA4 nano - drug - loading system had better dispersion and stable serum stability . The results showed that PEG - Phis60 / Pasp - A / CA4 nano - drug - loading system had better dispersion than that of PEG - Phis40 copolymer . ( 3 ) In MCF - 7 and MCF - 7 / ADR cells , the cytotoxicity , endocytosis and endocytosis of tumor cells were investigated by MTT assay .
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ460.1;TB383.1

【参考文献】