次氯酸液体敷料的制备及其质量评价

发布时间：2020-04-04 06:31

【摘要】：次氯酸(HClO)是一种具有强氧化性的不稳定弱酸,常温下仅存在于水溶液中。在日常生活中一般作为漂白剂、氧化剂、消毒剂使用。次氯酸作为皮肤用消毒剂,可以安全面迅速地杀灭临床上常见的细菌、真菌、芽孢杆菌和病毒,是一种非抗生素类的广谱杀菌剂,在低浓度条件下即可显示良好的杀菌效果。将人体内源性物质次氯酸制备成液体敷料,应用于皮肤软组织感染、皮肤机械性损伤伤口、手术切口,以此来实现杀菌消毒以及促进伤口愈合的作用。本文首先通过Sephadex G-150凝胶过滤柱和CM-Cellulose离子交换层析柱从新鲜猪血白细胞中提取髓过氧化物酶(MPO),通过紫外分光光度计对MPO提纯物在200～560nm波长范围内进行扫描,定性鉴别,通过不连续缓冲液系统SDS-PAGE凝胶电泳鉴定MPO的分子量,通过MPO测试盒测定MPO酶的活性,通过Bradford法测定MPO的蛋白浓度。通过实验室化学合成法(酸化次氯酸盐法)和髓过氧化物酶(MPO)催化法两种方法制取次氯酸溶液,通过抑菌实验和美蓝染色法对催化产物进行鉴别。然后加入相应的处方成分制备成次氯酸液体敷料。通过单因素实验对液体敷料所用增稠剂进行优选,控制液体敷料的流动性;通过正交试验优化次氯酸液体敷料中次氯酸(HClO)、次氯酸钠(NaClO)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、磷酸氢二钠(Na2HP04)的处方用量;考察4℃℃温度下,避光、光照条件以及不同温度(4℃、25℃、40℃)条件次氯酸液体敷料的有效氯含量、氧化还原电位(ORP)值的变化情况,对次氯酸液体敷料稳定性的影响因素进行探讨。采用薄膜过滤法建立次氯酸液体敷料的微生物限度检查方法,对次氯酸液体敷料进行无菌评价,消除杀菌成分的影响,保证敷料本身无菌。选取伤口感染的常见病原菌大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),其中大肠杆菌为革兰氏阴性菌的代表,金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌的代表,绘制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌生长曲线,找到微生物生长对数期,分别通过抑菌实验和菌液定量杀灭实验,计算抑菌圈直径与杀灭率,验证次氯酸液体敷料的体外杀菌效果。通过建立与临床上皮肤软组织感染较为接近的小鼠模型,验证次氯酸液体敷料的体内杀菌效果。通过医用胶带反复粘贴(tape stripping,TAP)法破坏小鼠皮肤屏障,于皮肤破损处接种相应浓度的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌液,建立小鼠皮肤软组织感染模型,设立观察指标,给予次氯酸液体敷料进行实验,验证杀菌效果。本实验成功提取了髓过氧化物酶,通过紫外分光光度计与酶标仪分析得知纯化后的MPO光谱吸收有两个特征峰,波长分别为280nm和430nm。经不连续缓冲液系统SDS-PAGE凝胶电泳可知MPO提纯液显示三条带,与标准质量蛋白对照后,可知三条带的相对分子质量为64.7kDa、47.9kDa、13.4kDa。通过MPO测试试剂盒测得MPO酶活性为 5.53U/mL。Bradford 法测定 MPO 的蛋白浓度为 186.3ug/mL。通过实验室化学合成法和MPO催化过氧化氢(H2O2)、氯离子(cl-)体系,成功制备了次氯酸溶液。制备的次氯酸为淡黄色溶液,具有含氯消毒制剂的气味,通过抑菌圈实验和美蓝染色实验,验证了 MPO成功催化了 H2O2、cl-。两种方法制备的次氯酸溶液有效氯含量分别为48.08ppm、106.9ppm;氧化还原电位(ORP)值为177.67mv、272mv。催化产物对于金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为1.13cm。通过单因素实验发现CMC-Na作为液体敷料的增稠剂制备所得次氯酸液体敷料易于涂展,均匀细腻,离心后外观均匀且保持不变,黏度适宜,体系无气泡产生,故选用羧甲基纤维素钠作为液体敷料的增稠剂;通过正交试验优化得出最佳处方用量为次氯酸130uL,羧甲基纤维素钠2.0g,磷酸氢二钠0.2g。对次氯酸液体敷料进行稳定性考察发现温度对于次氯酸液体敷料的稳定性影响大,随着温度的升高,敷料的有效氯含量、ORP值衰减幅度增大,其中,40℃C条件下,敷料储存15d,有效氯含量减为0。光照条件与避光条件下,次氯酸衰减幅度相似,未见显著性差异(p0.05),敷料稳定性受光照条件影响远小于温度。无菌检查实验中,计数方法验证结果显示实验组回收率和稀释对照组回收率均大于70%,控制菌检查方法适用性实验结果显示,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌实验组均为阳性,对照组均为阴性,均符合中国药典的要求,消除了敷料本身杀菌物质的影响。通过绘制微生物生长曲线发现:在8～14h内,大肠杆菌数量显著增加,达到对数期;12～22h内,金黄色葡萄球菌数量明显增加,达到对数期。取次氯酸液体敷料和对数期菌液进行定量杀灭实验,结果表明经过10min,敷料对大肠杆菌杀灭对数值达到7.28,经过5min,敷料对金黄色葡萄球菌的杀灭对数值达到7.72。可见次氯酸液体敷料对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有良好的杀灭作用,对于金黄色葡萄球菌的杀灭作用要优于大肠杆菌。通过抑菌实验发现,敷料对大肠杆菌的抑菌圈直径为0.777cm,对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为1.077cm。通过进行动物实验发现:次氯酸给药三天后,小鼠皮肤红肿面积明显缩小,与给药前相比,大肠杆菌组小鼠皮肤红肿面积缩小1.69ccm2,金黄色葡萄球菌组小鼠皮肤红肿面积缩小2.52 cm2,与空白对照组相比有显著性差异(p0.05)。感染创面活菌检查结果发现次氯酸液体敷料对于小鼠大肠杆菌感染皮肤杀灭对数值可达8,对于受金黄色葡萄球菌感染皮肤微生物杀灭对数值为7.47,表明次氯酸液体敷料对于小鼠伤口感染致病菌有良好的杀灭作用和修复作用。
【图文】：

模型图,次氯酸,产生过程,模型

图１－１次氯酸３Ｄ模型逡逑

次氯酸,产生过程

逑、逦图１－１次氯酸３Ｄ模型逡逑次氯酸是生物学专业上己知的一个重要的活性杀菌物质，是活性氧体系中的一种物逡逑质［７＿８］。次氯酸最显著的化学性质是强氧化性和不稳定性，因为在常温下很容易分解，逡逑所以纯的次氯酸很难见到，一般制备出来就立即使用［９］。人体内次氯酸由嗜中性粒细胞逡逑（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）产生来杀灭细菌［１（）］，它被广泛用于含氯消毒剂产品。逡逑１．２．２次氯酸的研究历程逡逑１９７６年，，次氯酸的杀菌作用首次得到证实。逡逑１９７９年，次氯酸的杀菌机理得到进一步揭示。Ｔｈｏｍａｓ邋ＥＬ发现次氯酸通过损坏细菌逡逑ＤＮＡ、蛋白（硫醇、硫醚和氨基）、以及酶失活作用，包括切割肽键和氧化细菌成分巯逡逑基［１１］
【学位授予单位】：哈尔滨商业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943;TB34

【参考文献】