基于抗粘附纳米界面的循环肿瘤细胞的高效捕获与纯化

发布时间：2020-05-13 10:30

【摘要】：循环肿瘤细胞(CTCs)检测被认为是一种极具发展前景的癌症液体活检技术。然而,血液中的CTCs数量非常稀少,并且存在异质性,使得从血液样品中高效捕获高纯度、高活性的CTCs成为一项极具挑战性的任务。纳米结构基底的引入提高了 CTCs的捕获效率,然而也增加了对血液中白细胞的捕获,白细胞对于CTCs的鉴定、分析和应用具有严重的干扰,因此对于CTCs的研究首先需要建立能够高效高纯度、高活性捕获CTCs的平台。基于上述目的,本论文的研究内容尝试从“材料选择、界面构筑、分子设计、释放策略”等方面进行设计,构建了包括纳米纤维@水凝胶基底、抗粘附纳米水凝胶基底、温敏纳米纤维基底、水凝胶@磁纳米颗粒基底及荧光双抗体磁纳米颗粒基底在内的几种CTCs捕获与纯化平台,并详细研究了其抗粘附、特异性、灵敏度等相关性能,主要内容包括以下五个部分:1.通过自由基聚合反应在玻璃片表面修饰一层聚羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯(PCBMA)水凝胶,该水凝胶层既可以起到抗粘附作用提高CTCs的捕获纯度,又提供了一个类似于细胞外基质的柔软界面。为提高捕获效率,通过静电纺丝技术在水凝胶表面电纺一层壳聚糖纳米纤维使捕获基底具有纳米结构,最后引入上皮粘附分子(EpCAM)抗体作为亲和捕获分子用于特异性捕获EpCAM高表达的CTCs。该基底通过亲和捕获分子、纳米结构和水凝胶抗粘附的协同作用完成了CTCs的高纯度高效捕获。2.上述捕获基底,虽然对CTCs捕获有较好的捕获效率和特异性,然而其基底制备过程复杂繁琐,因此在上一个工作的基础上,期望构建一种制备简单、经济的捕获基底。在该工作中,以甲基丙烯酸磺酸甜菜碱(SBMA)和甲基丙烯酸(MAA)为单体,N'N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂,通过回流沉淀聚合方法制备水凝胶纳米球,将其修饰到玻片表面构建了水凝胶纳米结构基底,引入EpCAM抗体作为亲和捕获分子。该基底本身具有良好的抗粘附性能,无需进一步修饰抗粘附分子,简化了实验过程。最后进行了临床病人血样检测,4例癌症患者1 mL血液中检测到1-32个CTCs,而作为对照的5例健康血样中均未检测到CTCs。3.对于CTCs的纯度,可以通过其特异性释放进一步提高,且CTCs的释放对于CTCs的后续研究同样具有重要的意义,因此在该工作中,利用静电纺丝技术制备了壳聚糖纳米纤维基底,通过原子转移自由基聚合方法(ATRP)将N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)和MAA修饰在纳米纤维表面,最后引入EpCAM适配体。利用PNIPAM的构象改变过程清除基底上的非特异性吸附的血细胞,使捕获的CTCs得到纯化。此外,通过互补序列(CS)高效的与适配体杂交实现捕获的CTCs无损释放,由于细胞释放过程是特异性作用,这使得释放的CTCs进一步得到纯化。4.由于纳米结构基底捕获方式的局限性,可能导致其在临床样本应用中捕获灵敏度的降低。不同于纳米结构基底的捕获方式,磁性纳米颗粒分离细胞属于均相溶液法,可以促进磁纳米颗粒与CTCs的接触,从而提高CTCs在血液样本中的检测灵敏度和捕获效率。基于上述研究结果,将甜菜碱类两性离子化合物引入磁纳米颗粒表面用于减少磁纳米颗粒对非特异性细胞的吸附。在该工作中,以SBMA和MAA作为单体,以含有双硫键的N,N-双(丙稀酰)胱胺(BACy)为交联剂,通过回流沉淀聚合方法在磁纳米颗粒表面形成水凝胶壳。通过利用水凝胶层和EpCAM抗体的协同作用,一方面降低血细胞的粘附提高靶细胞的捕获纯度,另一方面通过谷胱甘肽降解水凝胶层清除捕获细胞表面的磁珠,最终得到完整无损的CTCs。5.上述捕获基底使用的亲和分子是单一的EpCAM抗体,然而在CTCs的研究中发现CTCs会经历间充质转化,转化后的部分CTCs膜表面EpCAM表达降低或者消失,因此单一抗体的使用造成对这部分细胞检测的损失。而转化后的CTCs可能是肿瘤转移的关键,对于这部分细胞的捕获具有重要的意义。因此基于上述工作的基础和对转化后CTCs捕获的需求,在该工作中,利用Stober方法在磁珠表面包裹二氧化硅层,同时包埋DiI染料,使磁珠带有荧光,然后接枝线性聚合物分子PCBMA。PCBMA不仅为EpCAM和神经型钙粘附蛋白(N-cadherin)两种抗体的修饰提供多位点,而且能够有效降低血细胞的粘附。N-cadherin是转化后CTCs主要表达的一种蛋白。利用两种抗体的协同作用,不仅能高效捕获EpCAM表达的CTCs,也能高效捕获间充质转化后EpCAM低表达或者不表达的CTCs。
【图文】：

［逡逑Ｌ逦ｔｕｍｏｕｒ邋ｃｅｌｌｓ逡逑图１．１邋ＣＴＣｓ转移过程示意图１６１逡逑１．１．２循环肿瘤细胞的应用逡逑虽然ＣＴＣｓ数量稀少，但是血液样本获取方便，并且它可能携带肿瘤多方面逡逑信息，使ＣＴＣｓ检测被认为是一种极具发展前景的癌症液体活检技术Ｉ％。该技术逡逑能通过非侵入性的方式获取肿瘤分子水平上的信息，因而对于肿瘤的早期诊断、逡逑预后监控、药物评估、个体化治疗以及理解转移机理都具有重要意义［１９＿Ｍ］。因此，逡逑近十几年，对ＣＴＣｓ的研究已经成为一个非常活跃的领域。２０１４年６月在ＰｕｂＭｅｄ逡逑的关键词“循环肿瘤细胞”中列出了超过１５，１９０种出版物，ＣＴＣｓ在逡逑ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ注册的大于２７０项临床试验中被用作生物标志物［２１］。逡逑ＣＴＣｓ的精确计数可以用于肿瘤分期的辅助手段［２２］、疗效监控复发预测逡逑【２４】、预后评估［２５＿２６］等临床应用。例如，研宄发现在７．５ｍＬ血液样本中检测到多逡逑于５个ＣＴＣｓ

图１．２循环肿瘤细胞的富集技术ｍｉ逡逑目前，基于循环肿瘤细胞的物理性质和生物性质己经有许多技术用于分离逡逑ＣＴＣｓ，如图１．２［￣。基于物理性质的分离方法主要是依赖于ＣＴＣｓ的大小、变形逡逑性、密度、或介电特性等与正常血细胞不同［３９］。密度梯度离心法、滤膜过滤方法、逡逑水动力分离法和介电泳（ＤＥＰ）细胞分离法等技术已经被发展用于从血液中提取逡逑ＣＴＣｓ［４（Ｍ３］。密度梯度离心法通常依靠分离液来分离细胞，ｃＴＣｓ主要在单核细胞逡逑富集层，使ＣＴＣｓ的纯度降低，不利于后期的鉴定［４Ｑ］。过滤方法通常能够实现高逡逑通量分离，，然而由于ＣＴＣｓ的大小不均一性，过滤膜可能将大的血细胞截留而不逡逑３逡逑
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TB383.1;R730.4

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本文编号：2661818