以碳纳米管为传热介质的红外加热便携式PCR平台的开发与应用研究

发布时间：2020-05-13 11:06

【摘要】：即时诊断(Point-Of-Care Testing,POCT)首次出现于20世纪90年代,是属于体外诊断器械的一个细分行业。由于其关注病人身边的及时快速检测,所以也常被称为床旁检测、分散检验、现场替代检测等。2016年9月,Yole Développement公司在年度分析报告中,将“即时诊断”这个概念更新为“即时需求诊断(Point-of-Need Testing,PoNT)”。与即时诊断相比,即使需求诊断包含了更大的检测范围,除了人类疾病相关的检测,也包括兽医检验、工业检验(油、气体以及化学品等)、农业食品检测(奶制品、食品、饮料、庄稼等)、环境监测(水质监控和细菌检测等)和法医学等领域。微流控(Microfluidics)技术是一种依托于现代微加工工艺,在微米尺度下的处理和操纵微流体的技术手段。这种技术可实现采样、稀释、加试剂、分离、检测等实验步骤并可将各种生化反应集成在几平方厘米或更小的芯片上,从而减少样品和试剂的消耗、提高检测灵敏度、缩短反应时间并降低平均成本。微流控技术的核心是高度集成、微型化的芯片,该技术可满足从生物小分子到细胞等不同尺度对象的检测需求,并通过在后端耦合光、电、热等形式的检测器和读数装置,实现检测流程的自动化和检测结果的信息化。基于微流控技术的诊断仪器的微型化、集成化、自动化的特性,高度切合PoNT的发展需求,对优化临床检测具有重要意义。近年来已日渐成为PoNT领域的研究热点和核心技术。PCR芯片就是在这种趋势下诞生的。PCR芯片不只是微流控芯片的一个应用,其样本驱动、温度控制和信号检测等功能需要结合微机电系统(MEMS,MicroElectro-Mechanical System)的技术,尤其是在便携式的PCR检测设备中。本文探索了利用多壁碳纳米管作为传热介质并结合红外LED作为便携式PCR仪加热方式的可行性,开发了三套PCR平台及其配套的微流控芯片与PCR产物检测方法。在这三套平台中,主要控制原理均是通过PID算法和脉冲宽度调制技术控制红外LED的电压信号从而调节红外LED输出功率的大小从而调节升温的快慢,而降温控制和PCR产物的检测方式各不相同。在红外激发的导热油与碳纳米管循环流动PCR平台中(IR mediated Conducting Oil and CarbOn Nanotube circUlaTing PCR,IRCOCONUT PCR),我们设计了多层的微流控芯片,利用铜箔对导热油层和PCR腔室层进行传热,降温过程通过PID算法和脉冲宽度调制技术控制蠕动泵的转速从而将芯片内高温的导热油用油箱里低温的导热油取代实现降温功能。在这部分试验中,我们利用HPV 16型作为演示,对IR-COCONUT PCR平台的性能进行了验证。试验表明,IRCOCONUT PCR平台升温速度可以达到1.5°C/s,降温速度可以达到-2.0°C/s,与商用PCR仪性能相当。随后,为了减少样本测量中的人工操作,我们设计了与微流控芯片配套的缓冲液芯片、层流分析试纸条以及层流分析试纸条支架。最终,我们利用IR-COCONUT PCR平台、微流控芯片和层流分析试纸条,在50分钟之内完成30个温度循环并在25分钟之内实现目标产物的快速检测。在第二个红外PCR平台中,我们利用了3D打印设计了底部有微腔室的微流控芯片,该芯片可以在一次进样后将样本分区并保证各分区间没有交叉污染。同时,与IR-COCONUT平台中的微流控芯片不同的是,在底部有微腔室的微流控芯片中,导热油与样本是直接接触的。在与之配套的PCR平台中,我们设计了用于荧光检测的光路支架:支架上方为红外LED,用于对主通道中的导热油与碳纳米管进行加热,支架下方为蓝光LED、滤光片以及CCD摄像头,用于对PCR产物的荧光信号进行检测,支架侧方为USB风扇,通过PID算法和脉冲宽度调制技术控制风扇的转速从而对芯片进行对流降温。随后,我们利用Ansys对微腔室的结构尺寸以及传热进行了仿真模拟并优化了微流控芯片的设计。该红外PCR平台和PDMS微流控芯片升温速度可以达到2.5°C/s,降温速度为-0.9°C/s,可在90分钟内完成40个循环。通过CCD摄像头在每个循环延伸结束时采集荧光照片,随后通过软件去掉背景光等干扰,可以成功检测病人HPV 3种亚型的感染情况。最后我们开发了红外激发的RNA恒温扩增PCR平台(IR MEdiated RNA Isothermal RT-PCR,IR-MERIT PCR),该平台主要由三个模块组成:温度控制模块、荧光检测模块和定位模块。由于该平台用于恒温扩增,因此只需利用PID算法和PWM信号控制红外LED即可实现控温功能,而不再需要实现降温功能的硬件。我们利用3D打印制作了定位模块的主要部件,可灵活得实现多腔室荧光信号的采集。我们还利用图案化的材料制作了具有三维通道结构的微流控芯片,这种制作方式更便于集成微泵、微混合器以及微阀等功能。最后,我们利用IR-MERIT PCR、微流控芯片以及光电二极管实现了沙眼衣原体、解脲脲原体以及生殖支原体三种疾病的同时检测。我们设计的三套PCR平台及其配套的微流控芯片展示了其在现场和即时需求诊断领域对基因或传染病的快速检测能力,对设计、制作小型化的便携检测仪器提供了技术方案。
【图文】：

示意图,唾液,层析,样本

上海交通大学博士学位论文献报道用粗血清实现实时 PCR 或者用预加热处理的血液直接实现 LAMP 恒温扩增[65]。然而对于大多数情况，样本的前处理是必需的，而且对纸基微流控来说也是一项挑战[66]。有些样本预处理是在芯片外部实现的，，如利用自动或手动的非便携设备实现痰液[67]、唾液[68]、粪便[69]或尿液[70]的处理，这也是目前大多数商用 POCT 设备的现状，所幸的这个现状正在众多研究人员的努力下渐渐改变[70-73]。由于样本的来源有多种可能性，因此样本的动力黏度也是在一个较大的范围内波动，大约为 1×10-3到 30Pa·s[74-76]。根据 Lucas-Washburn 定律，流速与粘度平方的倒数成反比，这会限制有些样本的移动距离小到只有几个毫米。而实际中很多作者找到了相应的解决办法。在实际样本中，尿液（动力黏度约为 8mPa·s）是不需要考虑黏性因素的[77]。尿液分析试纸[78]、验孕棒[79]和一些早期层流分析纸[80]是直接用纸吸取尿液样本的，但对于一些传染性疾病，尿液是否是一个合适的样本是有争议性的[81]，比如尿液成分仅能对 HIV 感染者进行结核检测。唾液（动力黏度约为 8mPa·s[82]）也是可以不用稀释直接处理的样本。唾液大概能在纸基微流控通道中流过 2cm 的距离，所以也有研究者为了使之流经更长的距离而在实际分析中引入了稀释的步骤[83]。唾液的稀释是通过搭接试纸条实现的，而且稀释的比例也是可调的[84]。值得注意的是，近年来有很多检测 HIV、丙型肝炎和 HPV 的病原都是采用的唾液样本做的[85]。尽管精液黏度比较大[86]，但不用稀释也是可以直接用纸基检测的；而目前基于纸基的检测还没有直接用痰液（动力黏度约为 20-70mPa·s[87]）作样本的。

纸基,全血,材料,红细胞

上海交通大学博士学位论文1.4.2 全血过滤血液是非常重要的一种复杂样本，其是有红细胞、白细胞、血小板、外泌体和其他一些生物分子等组成。由于其成分的复杂性，因此多数情况下必须经过过滤，避免其中的一些成分干扰扩增。而目前基于尺寸排阻的层析法可以成功移除免疫球蛋白 G、血红蛋白（红细胞中）和乳铁蛋白[89]（白细胞中）等对 PCR 扩增有显著抑制作用的成分。纸的多孔微结构和其具有的毛细作用力可以自发的根据尺寸过滤红细胞，再结合有些抗体可以促使红细胞团聚，因此利用这个特性直接从血液中提取血浆。血和纸在医院妇产科中被用作新生儿血型化验已经有几十年的历史了[90]：格思里氏试验卡可以用作储存指尖血血迹，而干血迹可以保存数天到数月而不失效。在核酸扩增检测领域，干血迹主要用来做 HIV 的检测[91, 92]，其他疾病[93]如血红蛋白病、Duchenne 型肌营养不良和囊性纤维化也要报道。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TH77;TB383.1

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