金纳米复合物的合成及其胰腺癌靶向性成像和微波热增敏效应的实验研究

发布时间：2020-05-16 04:31

【摘要】：纳米技术在生物医学领域具有广泛的应用前景,是科研工作者们关注的热点。在目前研究较多的纳米材料和复合物中,金纳米颗粒易于表面修饰,具有良好的生物相容性,优秀的光学、热学和电磁学特性,还能够被制成多种形状,自身特性又随着其形状和大小的改变而改变,在靶向性成像和肿瘤治疗的方面具有可观的应用研究价值。胰腺导管内腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDA),是全球性的恶性肿瘤。胰腺癌患者早期没有明显的症状和体征,绝大多数患者在确诊时都已是晚期,错过了手术治疗时机,而胰腺癌对其他临床治疗手段又不敏感,故预后较差。胰腺癌患者五年生存率为5%左右。本文利用化学溶液反应的方法制备两种金纳米复合材料,并研究其在胰腺癌的诊断和肿瘤治疗中的初步应用。课题组的远期目标是将不同的金纳米材料进行优化组合,最终得到一类诊疗一体的纳米复合物。第一部分目的:制备结合有GPC-1抗体的金纳米簇复合物Gd-Au-NC-GPCAb-1,观察该复合物的表征及生物相容性,并通过将该复合物应用于离体胰腺癌细胞和裸鼠皮下胰腺癌移植瘤模型的靶向实验,分析其作为诊断胰腺癌的荧光成像(Fluorescence Imaging,FI)和磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)双模态靶向性成像纳米探针的可行性。实验方法:一、Gd-Au-NC-GPCAb-1的制备先用生物矿化法合成载钆纳米金簇Gd-Au NCs,再其表面修饰GPC-1抗体,制备双模态靶向性纳米复合物Gd-Au-NC-GPCAb-1,观察该复合物的形态特征和结构稳定性,测量该复合物的磁共振弛豫率等实验值。二、Gd-Au-NC-GPCAb-1的毒性实验把不同浓度(0~150mg/L)的Gd-Au-NC-GPCAb-1溶液和Gd-Au NC溶液分别与人类胰腺癌细胞株COLO-357和人类正常肾上皮细胞株293T一起培养孵育,通过CCK-8试剂盒检测不同组别两种细胞的存活情况;对经静脉分别注射纳米复合物和生理盐水24h后的裸鼠的心脏、肝脏、肾脏、脾脏和肺进行切片HE染色,观察对比注射后这些脏器的组织学改变;提取静脉注射纳米复合物24h后的裸鼠血液样本进行生化检测。三、Gd-Au-NC-GPCAb-1的成像实验建立裸鼠胰腺癌移植瘤模型:取浓度为5×10~6/mL的COLO-357细胞悬液,注射于雌性4至5周龄裸鼠右侧腋部,待瘤灶生长至60mm~3大小时,挑选出若干只裸鼠切取肿瘤样本做免疫组化检测。体外培养COLO-357细胞和293T细胞,将两种细胞悬液分别与未连接抗体的Gd-Au NCs和Gd-Au-NC-GPCAb-1一起孵育培养24h。用共聚焦显微镜观察纳米复合物与细胞的吸附结果;再使用胰酶分别消化两种细胞,分别与未连接抗体的Gd-Au NCs及Gd-Au-NC-GPCAb-1纳米复合物一起孵育培养1h,然后取样进行流式细胞实验。将移植瘤模型动物经腹腔注射麻醉后分两批,一批在IVIS Lumina II小动物活体光学成像系统下进行FI,另一批在西门子3.0T磁共振扫描仪下进行MRI。将每一批的荷瘤裸鼠随机分三组,经尾静脉分别注射0.2mL的生理盐水、未连接抗体的Gd-Au NCs溶液及Gd-Au-NC-GPCAb-1溶液,对比注射不同溶液前后裸鼠移植瘤的荧光图像和MR图像。测量注射后10min,30min和40min移植瘤部位的荧光强度,观察注射后10min,30min,60min和120min的移植瘤部位的T2WI信号值。结果:一、Gd-Au-NC-GPCAb-1的制备Gd-Au-NC-GPCAb-1纳米复合物成功制备,颗粒大小均匀一致,稳定性好;复合物的横向弛豫率(r2)与纵向弛豫率(r1)的比值处于合适范围内,说明该纳米复合物可以作为MRI阳性对比剂。二、Gd-Au-NC-GPCAb-1的毒性实验不同浓度的Gd-Au NCs对两种细胞均没有表现出明显毒性作用;Gd-Au-NC-GPCAb-1对293T细胞也没有表现出毒性作用,但对于胰腺癌细胞具有浓度依赖性的毒性。注射复合物溶液后不同实验中裸鼠器官的HE染色结果无明显差异;裸鼠血液样本的生化检测结果同样显示两组动物没有明显差异。以上结果说明复合物的生物相容性良好。三、Gd-Au-NC-GPCAb-1的成像实验免疫组化染色和IOD值测定都显示GPC-1在胰腺癌肿瘤组织的表达明显高于邻近的正常组织。COLO-357细胞与Gd-Au-NC-GPCAb-1孵育之后,可在细胞表面能够观察到较强的红色荧光信号,且Gd-Au-NC-GPCAb-1与COLO-357细胞的结合率最高。经荷瘤鼠尾静脉注射Gd-Au-NCs后,动物移植瘤部位的荧光强度逐渐升高,在10min时达最高,之后的30min缓慢降低。而注射Gd-Au-NC-GPCAb-1之后,动物移植瘤部位的荧光强度逐渐升高并在30min时达到峰值,之后的10min内降低。荷瘤裸鼠注射Gd-Au-NC-GPCAb-1后,移植瘤的MR信号值逐渐升高,在大约30 min时升到最高。而注射Gd-Au NCs后的移植瘤信号是在60min内缓慢升高,并在这之后的60min内缓慢降低。结论:纳米复合物Gd-Au-NC-GPCAb-1成功制备,结构稳定,生物相容性好。Gd-Au-NC-GPCAb-1能够与COLO-357细胞靶向性结合;静脉注射Gd-Au-NC-GPCAb-1后的裸鼠移植瘤部位的荧光图像强度和磁共振T2WI图像信号显著升高。因此Gd-Au-NC-GPCAb-1对特异性表达GPC-1的胰腺癌细胞和组织具有良好体内外靶向作用。第二部分目的:合成由氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)和金纳米棒(Gold Nanorod,GNR)构成的纳米复合物(GO/GNR),观察该纳米复合物的表征及生物相容性,并将其应用于裸鼠皮下胰腺癌移植瘤的微波消融实验,分析其作为微波消融的热增敏剂的可行性。实验方法:一、GO/GNR的制备参考本课题组的过往研究,我选用一种晶种介导生长法制备GO/GNR纳米复合物。先用聚苯乙烯磺酸钠(Polystyrene Sulfonate,PSS)修饰GO形成GO-PSS,后在其表面添加金的晶种,晶种逐渐完成生长形成金纳米棒,得到GO/GNR。二、GO/GNR的表征测定和毒性实验我将通过透射电镜,扫描电镜和X射线光电子能谱仪等仪器来测定复合物的形态学特征。将不同浓度(0~200mg/L)的GO/GNR溶液与人类肾上皮细胞株293T一起培养孵育24h,通过CCK-8试剂盒测定细胞的存活情况;对分别静脉注射纳米复合物和PBS溶液24h后的裸鼠的心脏、肝脏、肾脏、脾脏和肺进行切片HE染色,观察注射后对比这些动物脏器的组织学改变。三、GO/GNR的胰腺癌微波消融热增敏实验我运用与课题第一部分相同的方法建立动物模型。在瘤灶生长超过100mm~3大小时,选取合适的动物,分为3组,处理方法分别为,直接进行单纯微波消融,先瘤内注射0.2mL生理盐水后再进行微波消融,瘤内注射0.2mLGO/GNR溶液后再行微波消融,消融功率为(10W,2min)。对比不同组的裸鼠消融后的瘤灶MRI图像,测量冠状位和横断位下消融灶的最大径。结果:一、GO/GNR的制备GO/GNR纳米复合物成功合成。二、GO/GNR的表征测定和毒性实验观察发现GO/GNR的形态规则,结构稳定。XPS能谱分析的结果表明GO与GNR的结合是基于共价键的形式,而非π π堆积作用。CCK-8实验结果表明,GO/GNR对293T细胞仅存在较低的毒性,仅在金浓度为200mg/L的时候有一定表现。裸鼠脏器的HE染色结果显示两组动物的所有器官没有明显的差异。三、GO/GNR的胰腺癌微波消融热增敏实验MRI图像显示,经瘤内注射GO/GNR溶液后的裸鼠移植瘤灶经过微波消融后的消融面积较另外两组大,具有统计学意义(P0.05)。而注射生理盐水组和直接消融组的消融面积没有显著的差异(P0.05)。表明了GO/GNR确实有一定的微波热增敏效应。结论:第二部分实验合成GO/GNR纳米复合物,同样具有良好的稳定性和生物相容性。裸鼠胰腺癌移植瘤模型上进行的实验结果证明,如果将该复合物于微波消融前注入肿瘤内,其能够在消融过程中产生一定的热增敏效应,使有效消融范围增大。该复合物同样有望在未来用于临床上的肿瘤微波消融治疗。
【图文】：

流程图,流程,抗体,混合液

金纳米复合物的合成及其胰腺癌靶性成和微波热增敏效应的实验研究2、连接抗体利用 EDC 作为催化剂将抗体与上一步中合成的 Gd-Au NC 连接[35]。方法如下：（1）取 30mg 已经合成的 Gd-Au NCs 溶解于 900μL PBS 溶液中，另取 10mg固态 EDC 溶解于 100μLPBS 溶液中。（2）将两种溶液在室温下混合，，放入超声波清洗机处理 5min。（3）加入 30μLGPC-1 抗体溶液，将混合液置于室温下避光搅拌 2h。（4）将混合液以 4000rpm 的转速离心 20min 滤过，用 PBS 溶液清洗三次，便得到 Gd-Au-NC-GPCAb-1 固体。将其溶解于超纯水中备用。

金纳米复合物的合成及其胰腺癌靶向性成像和微波热增敏效应的实验研究

Gd-Au-NC-GPCAb-1的表征及Gd-AuNC的部分表征
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.9;TB383.1

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